[发明专利]一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法

说明书

本发明公开了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。本发明提供了一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10‑12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶。

技术领域

本发明涉及一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。

背景技术

共羧化酶(Cocarboxylase，也称为辅羧酶、硫胺焦磷酸酯或二磷酸酯)是维生素B1焦磷酸酯的内盐，其通常还以四水合物(Cocarboxylase Tetrahydrate，又称四水合辅羧酶或四水合硫胺焦磷酸酯)或盐酸盐(又称焦磷酸硫胺素或氯化维生素B1焦磷酸酯)的形式存在。

共羧化酶同样可与特定的蛋白质一起形成几种酶，它们催化人类和动物有机体代谢中的许多重要反应。

已有文献报道焦磷酸硫胺素的制备方法较多。1937年，Stern和Hofer利用维生素Bl和三氯氧磷反应制备了焦磷酸硫胺素[cf.Science,Vol.85,p.483(1937)]。J.Weijlard和H.Tauber利用维生素B1和焦磷酸钠与磷酸的混合液制备了焦磷酸硫胺素，通过利用磷酸钙溶液与大量的有机溶剂处理得到硫胺焦磷酸酯，收率在10％左右[cf.Joural of theAmerican Chemical Society,Vol.60,p.2263(1938)]。1940年，文献报道VB1类似物5-溴化乙烯噻唑和磷酸银反应制备氯化VB1焦磷酸酯，以银盐的形式析出，用硫化氢除去银离子,然后用氯化氢处理得到氯化硫胺焦磷酸酯[cf.Biochemical Journal,Vol.34,p.980(1940)]，上述方法需要用到有毒试剂或者大量的有机溶剂，或者温度较高，不利于环境保护。

US5047223、US2991284、CN1887891A、CN101787048B公开了维生素B1为原料，和磷酸化试剂(例如五氧化二磷与磷酸反应产生的焦磷酸)发生磷酸化反应，先经弱碱性阴离子柱(主要吸附住副产物维生素B1三磷酸酯、维生素B1四磷酸酯等高级磷酸酯，以及磷酸)，浓缩，后经弱酸性阳离子交换树脂纯水洗脱(在水淋洗时牢牢吸附住维生素B1磷酸酶，而辅羧酶却可以毫无保留的洗出，当该树脂柱用10％盐酸淋洗时，又可以将维生素B1磷酸酯完全洗出)，35℃下浓缩，加乙醇析晶可得到产物(最终产物纯度达到99％)，离子柱预处理以及再生过程十分繁琐，2次离子柱，2次35℃下浓缩水所用时长较大。

JP03145495提到产物的分离和提纯，将所得的磷酸混合物过强碱性阴离子柱离子交换树脂，纯水中加入醋酸(或甲酸、丙酸)洗涤，pH5.5洗脱液用乙醇析晶，为焦磷酸盐，pH＞5.5洗脱液用丙酮析晶为单磷酸盐，纯度最高为96％。

US2991284的实施例2中提到将2kg盐酸硫胺素磷酸化所得的磷酸盐混合物先过强碱性离子交换树脂(permutit ES)在pH 6.6-6.0时，得到单磷酸盐；pH在6.0-5.4下，得到单磷酸盐和焦磷酸盐的混合物，其中单磷酸盐占25％-30％；当pH为5.4-2，得到纯的羧化酶四水合物，该过程中得到纯的焦磷酸酯含量极低，约3％，硫胺磷酸酯和二磷酸酯的分离度较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的共羧化酶的纯化方法繁琐、效果差的缺陷，而提供了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。采用本发明的纯化方法可经一步离子交换得到高纯度(99％以上)的共羧化酶，并可进一步直接制备得到高纯度的四水合物或焦磷酸硫胺素。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。