[发明专利]一种提升痤疮杆菌耐药突变及耐药基因检测准确性和效率的方法及其配套试剂盒

说明书

本发明公开了一种提升痤疮杆菌耐药突变及耐药基因检测准确性和效率的方法及其配套试剂盒，针对痤疮杆菌的23S rRNA基因上的2个位点2058和2059，以及一个耐药基因ermX，设计了ARMS(Amplification Refractory Mutation System)基因分型引物及配套探针。由此建立了提升痤疮杆菌耐药基因检测准确性和效率的方法和配套检测产品，具有高通量、便利、快速、准确、紧密贴合皮肤科的科学研究需求、成本较低的优点，具有非常光明的商业化前景。

技术领域

本发明属于痤疮杆菌耐药检测技术领域，具体涉及一种提升痤疮杆菌耐药突变及耐药基因检测准确性和效率的方法及其配套试剂盒。

背景技术

寻常痤疮(青春痘)是世界上最常见的皮肤病之一。在全球范围内，痤疮的患病率居于所有疾病的第8位，主要累及青少年人群及20～30岁的成年人，影响超过十亿人。在中国，国内多个省市开展的流行病学调查报道了在10～22岁范围内的不同人群中，患病率波动于36.4～54.9％之间。面部痤疮的发生，影响了患者的面部容貌，不仅给患者带来严重的心理负担，影响患者的社交、就业与生活质量，还可能导致自卑、抑郁。《中国痤疮治疗指南(2014)》指出，痤疮对青少年的心理和社交影响已经超过了哮喘和癫痫。国外研究也指出，痤疮患者更易焦虑、抑郁，失业率甚至自杀率也比同龄的非痤疮患者更高。

目前公认，痤疮杆菌在皮肤毛囊中的大量繁殖与痤疮有密切关系。在中国，皮肤科医生主要对痤疮患者使用大环内酯类抗生素，抑制痤疮杆菌的生长。长期使用抗生素会产生耐药性痤疮杆菌。因此，在科学研究中，确定痤疮杆菌对大环内酯类抗生素的耐药性具有重要意义。

使用现有的细菌学方法，可以对痤疮杆菌的耐药性进行检测。但是，痤疮杆菌属于厌氧菌，需要苛刻的培养条件与昂贵设备(厌氧手套箱或产气袋)，且生长缓慢。取得患者标本后，常需等待一周时间才能给出检测结果。并且由于操作上的繁琐，痤疮杆菌耐药性的检测费用昂贵、自动化程度极低，需要进行大量实验操作，不仅难以开展，对于进行相关研究的单位来说也成为一种负担。更重要的是，此前一直认为：一个病人面部痤疮杆菌群落的状态只有两种，一种是只携带耐药痤疮杆菌，另一种是只携带野生型(即不耐药)痤疮杆菌。但在实验中，我们发现大部分病人处于既携带野生型痤疮杆菌、又携带耐药痤疮杆菌的中间状态，只是耐药痤疮杆菌所占比例不同，在检测中即体现为ΔCt不同。而由于缺乏检测手段，这一现象并没有被描述过，属于本发明首次证实。

从这个角度来看，现有方法(分离纯化后进行PCR-测序或药敏实验)存在固有缺陷：如果某患者的面部痤疮杆菌种群中，耐药型痤疮杆菌比例较少，常规的分离纯化方法将无法将其分离、获得，从而出现假阴性的错误结果。由此导致医院检验科和研究者不愿、也不可能常规开展此菌的分离培养与耐药检测项目。因此，目前在世界范围内，科学界尚没有对大量痤疮患者进行耐药检测的实践，更没有一种准确性更高，效率更高的检测方法和配套产品提出。

痤疮杆菌的耐药主要由两种机制引起：基因组中携带ermX基因或携带23S rRNA基因的点突变A2058T、A2058G、A2059G，这四个指标有任何一个阳性，该痤疮杆菌即对大环内酯类抗生素药物(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)和/或林可霉素类抗生素耐药。

痤疮杆菌的23S rRNA基因的2058位点由野生型A突变为G或T，2059位点由野生型A突变为G，均可产生耐药性。其机制是，23S rRNA中肽酰转移酶的结构域V的碱基序列改变，使其与大环内酯类抗生素药物的结合能力减弱甚至无法结合。

ermX基因编码一种甲基转移酶，将药物结合位点甲基化，能够使痤疮杆菌产生对大环内酯类抗生素的耐药性，该基因序列见NCBI数据库。

我们提出，以上述三个检测对象，出现任何一个突变，即可判断为痤疮杆菌对大环内酯类抗生素耐药。其余位点因出现频率过低、且未得到科学界的充分验证，不列入本发明检测范围。