[发明专利]一种核酸跨膜运输载体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种核酸跨膜运输载体及其制备方法。所述的核酸跨膜运输载体由原料和负载药物组成，所述原料包括脂肪酸改性壳聚糖和胆固醇，所述负载药物为核酸类物质。由于壳聚糖分子上含有大量的氨基，利用界面反应在壳聚糖结构单元上引入长链疏水基团；从而使改性后的壳聚糖同时具有亲水基团（氨基糖区域）和双亲性基团（糖酯区域）；脂肪酸改性壳聚糖中氨基糖区域氨基的pka在6.5以下，能够为核酸类物质提供亲和性高的结合区域；而脂肪酸改性壳聚糖中的糖酯区域趋向于形成棒状胶团或层状胶团结构，从而使核酸类物质得到物理保护。棒状胶团或层状胶团结构在接近细胞膜时则容易发生翻转，从而易于插入细胞膜，为核酸类物质的跨膜运输提供动力。

技术领域

本发明涉及核酸类药物传递体的领域。具体地，本发明提供了具有“氨基糖区域”以及“糖酯区域”的脂肪酸改性壳聚糖的制备方法，以及有利于核酸的体内递送的组合物的组成。此外，本发明提供了制备此类组合物的方法以及测定此类组合物在生理环境中的稳定性的方法，可用于多种疾病的治疗。

背景技术

治疗性核酸包括例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒和免疫刺激性核酸。此类核酸通过多种机制起作用。RNAi的治疗性应用极其广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白质的任何核酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体在体外和体内模型中都已显示出特异性下调靶蛋白质的能力。然而，目前治疗性核酸的临床应用还面临的两个问题：首先，容易被血浆中的核酸酶水解；其次，进入细胞内部的能力有限。

针对核酸酶水解的问题，目前通常的办法是通过化学修饰的方式来掩盖核酸的酶切部位(例如硫代磷酸酯基团修饰)。例如，研究人员使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键合核苷酸间的磷酸二酯键；Uhlmann E等人对核苷酸的碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)或糖(例如，2'-修饰的糖)进行修饰(Antisense: Chemical Modifications.Encyclopediaof Cancer,第X卷，pp 64-81Academic Press Inc.(1997))；另外，研究人员还利用2'-5'糖苷键来提高核酸的稳定性 (US5532130)。然而，这些化学修饰在使治疗性核酸免受核酸酶水解的同时降低了该治疗性核酸的活性。

其次，治疗性核酸向细胞内传递可通过使用载体系统(例如聚合物、阳离子脂质)或通过化学修饰构建体(例如通过与胆固醇分子共价结合)来进行促进。为了尝试提高功效，研究者也已利用基于脂质的载体系统递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。目前阴离子(常规的)脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质/反义聚集体已经得到了一定的应用。尽管取得最新的进展，但本领域内仍然存在对适合于常规治疗用途的改进的组合物的需要。首先，待发明的组合物要具有更好的生物相容性以降低额外的免疫反应的发生；其次，该组合物可以以较高效率封装核酸，具有高的包封率，保护封装的核酸在血清中免受降解和清除，适合于全身性递送，并且提供封装的核酸的细胞内递送；再次，该组合物应具有合理的价格区间，从而能够惠及到更多的受众。

有鉴于此，特提出本发明，本发明提供了符合上述要求的新型组合物、制备所述组合物的方法以及使用所述组合物将核酸引入细胞的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种核酸跨膜运输载体及其制备方法，其组合物为脂肪酸改性壳聚糖、胆固醇和核酸类物质。由于壳聚糖分子上含有大量的氨基，利用界面反应在壳聚糖结构单元上引入长链疏水基团；从而使改性后的壳聚糖同时具有亲水基团(氨基糖区域)和双亲性基团(糖酯区域)；脂肪酸改性壳聚糖中氨基糖区域氨基的pka在6.5以下，能够为核酸类物质提供亲和性高的结合区域；而脂肪酸改性壳聚糖中的糖酯区域趋向于形成棒状胶团或层状胶团结构，从而使核酸类物质得到物理保护。而散的多股螺旋结构在接近细胞膜时则容易发生翻转，从而易于插入细胞膜，为核酸类物质的跨膜运输提供动力。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：