[发明专利]含有枯草芽孢杆菌漆酶的直接胆红素检测试剂盒

权利要求书

1.一种利用枯草芽孢杆菌漆酶制备的直接胆红素检测试剂盒，其特征是由试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4组成：

所述试剂R1包括：缓冲液100 mmol/L、甘露醇10-250 mmol/L、亚硝酸钠0.05-0.2 g/L、叠氮化钠0.2-2 g/L、乙二胺四乙酸钠0.001-5 g/L、余量为水；

所述试剂R2包括：缓冲液100 mmol/L、KCl 100 mmol/L、聚乙二醇-600 5-500 g/L、余量为水；

所述试剂R3：枯草芽孢杆菌漆酶；

所述试剂R4：直接胆红素标准品；

所述试剂R1中的缓冲液为pH=4.5-6.0的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、pH=4.5-6.0的柠檬酸钠-乳酸缓冲液、pH=4.5-6.0的甘氨酸-盐酸缓冲液或pH=4.5-6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；

所述试剂R2中的缓冲液为pH=4.5-6.0的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、pH=4.5-6.0的柠檬酸钠-乳酸缓冲液、pH=4.5-6.0的甘氨酸-盐酸缓冲液或pH=4.5-6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；

所述枯草芽孢杆菌漆酶用下述方法获得：

（1）构建含有枯草芽孢杆菌漆酶基因的大肠杆菌：设计枯草芽孢杆菌漆酶基因的上游引物和枯草芽孢杆菌漆酶基因的下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，利用所述上游引物与所述下游引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过酶切-连接的方式整合入大肠杆菌质粒pET-28a中，形成重组质粒pET-28a-laccase，并通过CaCl₂转化法转入大肠杆菌表达型宿主菌BL21 (DE3)中，得到重组菌；

所述枯草芽孢杆菌漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

（2）将步骤（1）获得的重组菌发酵，纯化，制备获得枯草芽孢杆菌漆酶。