[发明专利]一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术

权利要求书

1.一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，其特征在于，步骤如下：

1)样品制备及RNA提取

a.在生物安全柜内，取0.5mL溶液A，将咽拭子浸泡到溶液A中充分搅拌，并将棉拭子中的液体在管壁挤干净，盖上管盖，充分混匀，室温放置5min；

b.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混匀，室温放置3min；

c.12000rpm 4℃离心10min，取上清液；

d.将上清液加入1/2体积的溶液C，室温静置2min，并转移到核酸分离管；

e.12000rpm 4℃离心30s；

f.将离心管中的液体倒掉后，在核酸分离管中加入洗液D 500μL，8000rpm 4℃离心1min；

g.重复步骤f；

h.倒掉离心管中的液体，12000rpm 4℃离心2min，将核酸分离管甩干；

i.将核酸分离管放到新的离心管，加入20-50μL的洗脱液E，静置2min，12000rpm离心1min；

2)反应体系配置和PCR扩增

j.取荧光定量反应液F、溶液G或内标溶液12μL，加入8μL RNA或阳性模板，直接进行荧光定量PCR反应；反应条件如下：第一步，1次，42℃持续10min；第二步，1次，95℃持续10s；第三步，40个循环，95℃持续5s，然后60℃持续34s；

3)质量控制

空白对照和阴性对照无扩增曲线或Ct＞40；阳性对照在相应的检测通道有S型扩增曲线；内标溶液在相应的检测通道有S型扩增曲线；

4)结果分析与判定

在检测有效的情况下，利用荧光定量反应液F、溶液G进行扩增的结果，CT值同时小于或等于37，判断为新冠状病毒核酸检测阳性；CT值同时大于或等于40，判断为新冠状病毒核酸检测阴性；37＜CT值＜40，需要重复试验，如果CT值＜40，判断为阳性，CT值≥40，判为阴性。

2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，其特征在于，溶液A为Trizol试剂，溶液B为三氯甲烷，溶液C为乙醇，洗液D为75％乙醇溶液，洗脱液E为TE，荧光定量反应液F为RNA反转录酶、DNA聚合酶、dNTP、引物、引物探针的混合溶液，溶液G为DEPC处理水；其中，引物和对应引物探针分为X和Z两种，引物X上游5`-gaccccaaaatcagcgaaat-3`、下游5`-tctggttactgccagttgaatctg-3`和探针5`-FAM-accccgcattacgtttggtggacc-TAMRA-3`，引物Z上游5`-ttacaaacattggccgcaaa-3`、下游5`-gcgcgacattccgaagaa-3`和探针5`-FAM-acaatttgcccccagcgcttcag-TAMRA-3`。