[发明专利]一种肺癌和结直肠癌基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺

说明书

本发明公开了一种用于肺癌和结直肠癌基因检测的石蜡包埋参考品的制备工艺及其应用。该制备工艺包括以下步骤：A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；C、细胞的培养与收集；D、细胞的固定与脱水；E、细胞的包埋与切片；F、FFPE切片的HE染色，核酸提取与突变频率或拷贝数的确认。本发明的技术方案能很好的解决临床样本存在的数量少，不可重复获得，性能不稳定，突变位点稀缺，细胞包埋不均一等诸多问题。

技术领域

本发明属于分子诊断基因检测技术领域，具体涉及一种用于肺癌和结直肠癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺及其应用。

背景技术

近年来，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测，肿瘤易感预测，肿瘤早期诊断，个体化用药，术后监测以及消费型基因检测等。为了评判基因检测类试剂盒的准确性，灵敏度，稳定性等诸多性能，此类试剂盒在研发注册过程中都会采用参考品来对试剂盒的各项性能进行反复的验证。

目前很多试剂盒厂商选用的参考品都是新鲜细胞培养提取的基因组DNA溶液，或者临床来源的样本，但都尚且存在一定的问题：新鲜提取的基因组DNA溶液与临床肿瘤细胞存在很大的异质性，不能很好的模拟临床样本的检测；临床样本中很多基因突变类型来源稀缺，基因突变种类单一，基因突变频率不固定，不能作为试剂盒组分的优质来源；临床上低频突变样本极其罕见，不能很好的验证试剂盒的检测限等性能指标；临床样本都属于珍贵的研究材料，且数量有限，很难作为试剂盒研发注册的长期来源。

现有技术中也出现了一些用于基因检测类试剂盒参考品的石蜡包埋切片(FFPE)，例如：中国专利201910049671.X中公开了一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。该发明通过对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况。

中国专利201510130867.3中公开了一种微米级生物材料石蜡切片方法，能简单有效的固定微米级生物材料，如小鼠植入前胚胎。该方法得到了质量较好的小鼠植入前胚胎的石蜡切片，但是该方法中步骤繁琐，尤其是预处理步骤复杂，有进一步优化的空间。

目前市场上鲜有关于稳定，有效，可重复的用于肺癌和结直肠癌基因检测的石蜡包埋参考品的制备工艺，且已公开的工艺中存在很多不足：1、背景细胞系种类多，背景复杂，制作时操作繁琐且失败率高；2、包埋工艺不成熟，细胞包埋不均一，批间批内差异大；3、将不同细胞系分别做成FFPE切片，再进行核酸的提取和多种基因位点的混合，不利于长期储存；

综上，目前市面上无实际可用的肺癌和结直肠癌多基因检测FFPE参考品。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于肺癌和结直肠癌多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺及其产品和应用。本发明提供的制备工艺可以解决现有技术中临床上的石蜡切片样本作为参考品数量少，不可重复生产，无法获得低频率突变位点等技术问题。

术语：

1、本发明中，在本领域技术人员显而易见的使用惯例中，数字代表突变位置，单字母代表氨基酸类型，数字前一位字母代表突变前氨基酸类型，数字后一位字母代表突变后氨基酸类型。例如“EGFR T790M”，指EGFR蛋白第790位的苏氨酸突变为甲硫氨酸。

一方面，本发明提供了一种多基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺，所述的制备工艺包括以下步骤：

A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；

B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；

C、细胞的培养与收集；

D、细胞的固定与脱水；

E、细胞的包埋与切片；