[发明专利]一种肺癌和结直肠癌基因突变石蜡包埋参考品的制备工艺

权利要求书

1.一种用于肺癌和结直肠癌基因检测领域的石蜡包埋参考品的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

A、已知突变基因，突变位点和等位基因突变频率的细胞系的获得；

B、肺癌和结直肠癌多基因FFPE参考品的设计；

C、细胞的培养与收集；

D、细胞的固定与脱水；

E、细胞的包埋与切片；

F、FFPE切片的HE染色，核酸提取与突变频率或拷贝数的确认。

2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤A包括以下步骤：

A1、从文献或数据库中查阅相应的含有目标基因突变的细胞系；

A2、获取含有目标突变，遗传稳定的单克隆细胞系；

A3、单克隆细胞系等位基因突变频率的确定。

3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤B包括以下步骤：

B1、设计FFPE参考品的突变基因种类和突变频率；

B2、根据每一个突变位点的最终突变频率以及原始细胞(背景清晰的细胞)的突变频率，计算出每一种细胞系所需占的比例；

B3、根据每一种细胞系所占的比例计算出每一个蜡块里每一种细胞系所需要的细胞数量。

4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤D为采用终浓度为2-10％的PFA溶液对新鲜的细胞悬液进行固定；优选为8％的PFA溶液。

5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，在步骤F之后还可以包括质检步骤G；所述的步骤G为对步骤F制备得到的FFPE切片进行HE染色、核酸提取、突变位点的突变频率确认。

6.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述的目标基因突变包括：BRAFV600X、KRAS G12X、KRAS G13D、KRAS Q61X、NRAS G12X、NRAS G13D、NRAS K117N、NRAS Q61X、EGFR G719X、EGFR G797X、EGFR S768I、EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR L861Q、EGFR 19del、EGFR 19indel、EGFR 20ins、PIK3CA E542X、PIK3CA E545X、PIK3CA H1047X、EML4(13)-ALK(20)、EML4(6)-ALK(20)、CD74-ROS1；其中X包括E，G，K，M，R，A，C，D，R，S，V，H，L，K，R中的一种或多种氨基酸。

7.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，所述的步骤B1中基因突变的类型包括单核苷酸位点变异、插入或缺失、融合或拷贝数变异中的一种或多种；基因突变所包含的位点为1-20个，拷贝数为2-10个；基因突变的频率为1％-50％，优选为5％；所述的的细胞数量为100M-500M，优选为500M。

8.一种用于癌症基因检测的FFPE参考品，其特征在于，所述的参考品通过权利要求1-7所述的制备工艺制备。

9.一种癌症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求8所述的FFPE参考品。

10.权利要求8所述的FFPE参考品在分子诊断领域、实验室日常质控和室间质评中的应用。