[发明专利]基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法

说明书

本发明公开了一种基因重组大肠杆菌及5‑羟色胺的生产方法。本发明的基因重组大肠杆菌包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC。本发明利用基因重组大肠杆菌生产5‑羟色胺，反应条件温和、转化效果显著。

技术领域

本发明涉及一种基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法。

背景技术

5-羟色胺又称血清素(Serotonin)，是由L-色氨酸经羟化、脱羧两步反应得到的一种具高附加值的氨基酸衍生物，化学名称为3-(2-氨基乙基)-5-羟基吲哚。自然界中，血清素广泛存在于哺乳动物组织中，特别在其大脑皮层及神经突触内有较高含量，在植物和真菌中也存在少量分布。

在制药领域，血清素作为一种药物，可以参与生物体包括情绪调控、行为管理、睡眠周期维持、清除有害自由基等在内的多种生理功能。在农业领域，血清素的用途也十分广泛，如植物开花，形态发生，衰老等植物生理过程都有血清素的参与。

目前国内外血清素的生产还是以植物提取为主。例如，CN101337921B公开了一种从沙棘中制备5-羟色胺的方法。将沙棘果枝条进行采收和清洗，然后经过取汁、分离、水提取、过滤、离子交换、洗涤、洗脱、降酸、浓缩、乙醇提取、结晶得到5-羟色胺。又如，CN107827806A公开了一种从香蕉皮中提取血清素的方法，将香蕉皮加水破碎制浆得到浆液，向浆液中添加由甲醇和水混合而成的提取溶剂，并在超声辅助下浸提，然后经过过滤，向滤液中先后加入三氯乙酸和无水乙醇，静置沉淀；最后将沉淀物分别用无水乙醇和乙醚洗涤得到血清素。再如，KR20040084353A公开了一种从红花种子中提取5-羟色胺、木脂素和黄酮类化合物的分离纯化方法。将红花干种子烘烤，加入100％正己烷除去种子中的脂肪，再加入80％水溶性乙醇减压浓缩；用热水处理浓缩液，在热水处理浓缩液中加入果胶酶水解；水解产物经重离子传递，然后用水溶性乙醇洗脱再经凝胶柱层析得到5-羟色胺。植物组织提取法存在原料供应少、提取步骤复杂、提取率低的问题。

近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产5-羟色胺的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究，本领域内仍然需要生物合成5-羟色胺的新方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基因重组大肠杆菌，其具有产生色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC的能力。

根据本发明所述的基因重组大肠杆菌，其包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述基因重组大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC。

根据本发明的基因重组大肠杆菌；优选地，所述色氨酸羟化酶TPH基因为三角涡虫(Dugesia japonica)的色氨酸羟化酶TPH基因；所述色氨酸脱羧酶TDC基因为来自虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的色氨酸脱羧酶TDC基因；所述基因重组大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655。

本发明的另一个目的在于提供上述基因重组大肠杆菌的制备方法，其包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从三角涡虫的基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因，使用第二引物从虫拟蜡菌的基因组中扩增得到色氨酸脱羧酶TDC基因，使用第三引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-5HT。