[发明专利]基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法

权利要求书

1.一种5-羟色胺的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

将基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行扩大培养，获得扩大菌液；向扩大菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得5-羟色胺；

其中，所述基因重组大肠杆菌包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述基因重组大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC；

所述色氨酸羟化酶TPH基因为来自三角涡虫(Tryptophan hydroxylase)的色氨酸羟化酶TPH基因，基因序列如SEQ ID NO:8所示；所述色氨酸脱羧酶TDC基因为来自虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的色氨酸脱羧酶TDC基因，基因序列如SEQ IDNO:9所示；所述基因重组大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655；

其中，所述基因重组大肠杆菌的制备方法包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从三角涡虫的基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因，使用第二引物从虫拟蜡菌的基因组中扩增得到色氨酸脱羧酶TDC基因，使用第三引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-5HT；

所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，扩大培养使用的发酵培养基为不含抗生素的LB液体培养基，包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份，余量为水；扩大培养的条件为：温度25～37℃，转速100～300rpm。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，诱导剂在扩大菌液的OD₆₀₀＝0.4～1.4时加入到扩大菌液中；诱导菌体以OD₆₀₀＝5～60的浓度接种至转化液中；其中，OD₆₀₀表示溶液在600nm波长处的吸光值。

4.根据权利要求1～3任一项所述的生产方法，其特征在于，所述转化液包含以下组分：Tris-HCl缓冲液、甘油、L-色氨酸和四氢生物喋呤。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：

(1)采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；

(2)使用热激转化的方式进行质粒转化；和

(3)质粒验证。