[发明专利]一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒

说明书

本发明公开了一种线性化DNA载体pHB‑1质粒及用其制备的试剂盒，线性化DNA载体pHB‑1质粒的基因序列如SEQ ID NO：1所示；试剂盒包括线性化DNA载体pHB‑1质粒、高效T4DNA连接酶、PCR测序引物tL3‑seq和实验对照物；所述实验对照物包括编辑大肠杆菌MlaC基因的特异性gRNA序列引物、用于引入MlaC L11R点突变的DNA修复模板和用于确认MlaC L11R点突变的PCR测序引物；本发明的试剂盒可以对多种细菌进行基因编辑实验，具有可重复性及稳定性，并且可对1个或数个靶基因进行编辑操作，编辑效率可达90‑100％。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，属于高端生物技术领域，具体说是一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒。

背景技术

细菌的基因组编辑是通过打断、缺失或替换基因组上的目的基因而达到研究其功能和性状的目的，在基因编辑中具有重要的作用，其应用可以拓展到工程菌改造、抗生素研发、以及耐药机制研究等多个方面。虽然利用传统质粒转化的方法可在多种细菌中实现改造，但是耗时费力，不能精准控制基因组改造位置和改造序列，而且对于一个改造后的微生物要进行大规模测序和反复诱导。另外，还存在改造后性状不稳定，需要反复筛选才能得到稳定菌株，这都大大制约了研究与开发的进程。

随着基因组时代到来，大量微生物基因组序列被测序完成，在这种前提下，利用微生物基因组序列和新型基因编辑方法快速改造细菌基因组已成为可能。但是目前国内还没有公司开发针对细菌基因组编辑的试剂盒产品，而国外仅有Integrated DNATechnologies(IDT)、New England Biolabs(NEB)及Thermo Fisher等公司开发相关基因编辑产品用于科研，但是多集中于真核细胞的基因编辑，并没有简便易用的针对细菌基因组编辑的试剂盒产品，另外国外基因编辑试剂在我国零售价格偏高，甚至高于其国外定价的2倍以上，性价比很低；另外，利用市面上的试剂制备基因编辑所必需的sgRNA或进行载体构建，通常需要数天或数周时间。虽然可以用化学合成法直接进行sgRNA的合成，但是价格昂贵且由于细菌培养环境下广泛存在的RNA降解酶，并不适用于细菌的基因编辑。

因此自主研发一种可以对细菌基因组进行快速高效编辑的试剂盒是非常有必要，不仅能打破国外对细菌基因组编辑试剂盒的垄断，力争达到国外领先水平，而且对基因编辑试剂产业化发展也具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种线性化DNA载体pHB-1质粒，含有pSC101复制子、受自然启动子控制表达的Cas9基因、Gam基因、Beta基因、Exo基因和受IPTG诱导控制表达的gRNA；其中Gam基因、Beta基因和Exo基因均受阿拉伯糖诱导启动子ParaB控制；

线性化DNA载体pHB-1质粒的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还包括一种线性化DNA载体pHB-1质粒在制备对细菌基因组进行编辑的试剂盒中的应用。

本发明还包括一种试剂盒，包括线性化DNA载体pHB-1质粒、高效T4 DNA连接酶、PCR测序引物tL3-seq和实验对照物；

所述PCR测序引物tL3-seq用于确认gRNA系列是否正确连入pHB-1；

所述实验对照物包括编辑大肠杆菌MlaC基因的特异性gRNA序列引物、用于引入MlaC L11R点突变的DNA修复模板和用于确认MlaC L11R点突变的PCR测序引物；其中用于确认MlaC L11R点突变的PCR测序引物为两对，分别用于扩增出以编辑位点为中心的DNA片段和对PCR产物进行测序。