[发明专利]一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒

权利要求书

1.一种线性化DNA载体pHB-1质粒，其特征在于：含有对温度敏感的pSC101复制子、受自然启动子控制表达的Cas9基因、Gam基因、Beta基因、Exo基因和受IPTG诱导控制表达的gRNA；其中Gam基因、Beta基因和Exo基因均受阿拉伯糖诱导启动子ParaB控制；

线性化DNA载体pHB-1质粒的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述一种线性化DNA载体pHB-1质粒的用途，其特征在于：在制备对细菌基因组进行编辑的试剂盒中的应用。

3.一种包括权利要求1所述线性化DNA载体pHB-1质粒的试剂盒，其特征在于：还包括高效T4 DNA连接酶、PCR测序引物tL3-seq和实验对照物；

所述PCR测序引物tL3-seq用于确认gRNA系列是否正确连入pHB-1；

所述实验对照物包括编辑大肠杆菌MlaC基因的特异性gRNA序列引物、用于引入MlaCL11R点突变的DNA修复模板和用于确认MlaC L11R点突变的PCR测序引物；其中用于确认MlaC L11R点突变的PCR测序引物为两对，分别用于扩增出以编辑位点为中心的DNA片段和对PCR产物进行测序。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：靶基因特异性gRNA引物为一对互补的引物序列，然后在5’端分别添加ACAC和AAAC四个碱基，互补引物的总长度为24个碱基。

5.权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

①根据靶基因及其需要引用的突变设计靶基因特异性gRNA序列及其对应的引物、DNA修复模板和用于确认点突变的PCR测序引物；

靶基因特异性gRNA序列对应的引物为gRNA-F和gRNA-R；

DNA修复模板为Repair-F和Repair-R；

用于确认点突变的PCR测序引物为两对，分别为Seq-F1和Seq-R1、Seq-F2和Seq-R2；

②将gRNA-F和gRNA-R退火，然后与线性化DNA载体pHB-1质粒混合，加入高效T4 DNA连接酶，在16℃下反应2小时；

③连接反应完成后，取2μL转化至感受态大肠杆菌DH5α中，培养基中加入100mg/mL卡纳霉素，涂板，在30℃培养过夜；

④从步骤③得来的平板上挑选3～5个菌落，接种至3mL含有100mg/mL卡纳霉素中，在30℃高速震荡培养过夜，然后利用小量制备法提取质粒；

⑤利用PCR测序引物tL3-seq进行测序，确认靶基因特异性gRNA序列正确连接入线性化DNA载体pHB-1质粒；

⑥将DNA修复模板Repair-F和Repair-R退火；

⑦将靶细菌制备成电击感受态细胞，将步骤⑤确认好的质粒与步骤⑥退火后的DNA修复模板Repair-F和Repair-R共同转化到靶细菌中，培养基中加入100mg/mL卡纳霉素，涂板，并在30℃培养过夜；

⑧从步骤⑦得来的平板上挑选4～6个菌落，接种至含有100mg/mL卡纳霉素中，在30℃下高速震荡培养过夜，分取一半冻存，另一半提取基因组DNA进行编辑效率确认；

⑨利用PCR测序引物Seq-F1和Seq-R1扩增出以编辑位点为中心的DNA片段，然后利用PCR测序引物Seq-F2和Seq-R2对PCR产物进行测序。

6.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：DNA修复模板的长度40～60bp，并且两端同源重组臂为20bp以上。

7.根据权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：确认基因编辑成功引入突变的测序PCR引物使用方法为扩增以编辑位点为中心的DNA片段为400～600bp。

8.权利要求3所述试剂盒的用途，其特征在于：在编辑细菌基因组中的应用。