[发明专利]一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用

说明书

本发明公开了一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用，本发明将易于分离富集的磁球、比表面积大的纳米金和DNA步行者相结合，磁球能降低干扰物的非特异性吸附，纳米金能增大DNA序列的负载量，DNA步行者在酶的作用下可逐步切割信号分子导致电化学信号的变化。相比传统的电化学检测方法，该方法避免了在电极表面修饰DNA序列以及用封闭剂降低非特异性吸附等繁琐步骤，且具有极高的灵敏度，对靶点miRNA‑182的最低检测浓度可达1fM。本发明的检测方法测定范围宽，为0.001‑2pM，正常血清样品中miRNA‑182的含量约为0.2‑1pM，胶质瘤患者中约为1‑2pM，本发明的方法对正常血清样品以及胶质瘤患者血清样品中miRNA‑182的测定具有可行性。

技术领域

本发明属于生物材料及电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物细胞中的RNA调控因子，通常具有21个碱基左右的长度，在调控发育过程中发挥重要作用。研究发现，miRNA的异常表达与多种癌症相关，例如miRNA-182与胶质瘤有着密切的关系，这也使miRNA成为癌症诊断的新的生物学标志物，给人类疾病的治疗提供一种新的临床信息。但是由于其在细胞中的含量低、尺寸小和易降解等特点，定量检测细胞内的miRNA是非常困难的。

miRNA的传统检测方法有：Northern印迹法、实时聚合酶链反应(PCR)和miRNA的基因芯片检测等。其中，Northern印迹法被认为是miRNA检测的黄金标准方法，但是由于它操作繁琐，费时费力，灵敏度相对较低并且样品需要量大(10μg样品)等缺点使得它不适用于常规的临床诊断；PCR和基因芯片检测法存在效率低、耗时、经济性低、设备昂贵和操作复杂的缺点，限制了它们的生物和生物医学应用，因此，开发新的miRNA的检测策略是具有重要意义的。采用电化学传感器测量miRNA，主要是通过结合有DNA探针的纳米粒子材料对miRNA进行检测，其方法简单，成本低，因而得以飞速的发展，但缺点是检测限较高，因而研发DNA探针修饰的纳米粒子材料用于检测低浓度的miRNA有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高，选择性好，检测浓度低的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用。

本发明这种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)DNA修饰的纳米金：将氯金酸溶液与水混合后加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，继续加热反应，得到含金纳米粒子溶液；向含金纳米粒子溶液中加入一端修饰巯基、一端修饰生物素基团的DNA连接探针进行反应，反应完毕后，加入氯化钠老化，离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金；

(2)强导电性磁性纳米复合物的制备：将步骤(1)中DNA修饰的纳米金溶液加入到亲和素修饰的磁球溶液中进行反应，磁性分离除去未反应的纳米金，得到磁球-纳米金复合物；在磁球-纳米金复合物中加入氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，震荡，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物；

(3)混合探针溶液的制备：DNA步行者探针的一端和保护探针在水浴中杂交，得到DNA步行者探针和保护探针的杂交双链；接着将杂交双链与二茂铁修饰的信号探针进行混合，然后加入TCEP进行还原反应，还原二硫键，得到混合探针溶液；

(4)DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备：将步骤(3)中的混合探针溶液加入到步骤(2)中强导电性的磁性纳米复合物中进行反应，反应完毕后，磁性分离除去未反应的DNA链，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。