[发明专利]一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法及其产品与应用

权利要求书

1.一种基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）DNA修饰的纳米金：将氯金酸溶液与水混合后加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，继续加热反应，得到含金纳米粒子溶液；向含金纳米粒子溶液中加入一端修饰巯基、一端修饰生物素基团的DNA连接探针进行反应，反应完毕后，加入氯化钠老化，离心除去未反应的DNA，得到DNA修饰的纳米金；

（2）强导电性磁性纳米复合物的制备：将步骤（1）中DNA修饰的纳米金溶液加入到亲和素修饰的磁球溶液中进行反应，磁性分离除去未反应的纳米金，得到磁球-纳米金复合物；在磁球-纳米金复合物中加入氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，震荡，磁性分离除去未反应的氯金酸和柠檬酸钠，得到强导电性的磁性纳米复合物；

（3）混合探针溶液的制备：DNA步行者探针的一端和保护探针在水浴中杂交，得到DNA步行者探针和保护探针的杂交双链；接着将杂交双链与二茂铁修饰的信号探针进行混合，然后加入TCEP进行还原反应，还原二硫键，得到混合探针溶液；

（4）DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备：将步骤（3）中的混合探针溶液加入到步骤（2）中强导电性的磁性纳米复合物中进行反应，反应完毕后，磁性分离除去未反应的DNA链，得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。

2.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，氯金酸的浓度为0.005~0.015 g/mL，氯金酸溶液与水的体积比为1:(80~100)，柠檬酸钠的浓度为0.01~0.03 g/mL，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:(1~3)；加热反应时间为10~30 min；DNA连接探针浓度为5~15 mM，DNA连接探针与纳米金溶液的体积比为1:(15~25)，反应时间为6~12 h；所述的DNA连接探针为SH-T₃₀-Biotin，如序列1所示。

3.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述磁球的粒径为0.5~1.5 μm，磁球溶液浓度为9~11mg/mL，DNA修饰的纳米金的浓度为10~15 nM，DNA修饰的纳米金与磁球的体积比为35~45:1，反应时间为2~5h；氯金酸溶液的浓度为0.005~0.015 g/mL，柠檬酸钠溶液浓度为0.005~0.015 g/mL，磁球-纳米金复合物溶液、氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液的体积比为1:(7~9):(7~9)，震荡时间为0.5~1.5 h。

4.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，DNA步行者探针的序列为SH-T₄₀-GGT AGA ACT CAC ACT CCT CAGC，如序列2所示，保护探针的序列为TG AGG AGT GTG AGT TCT ACC ATT GCC AAA，如序列3所示，信号探针序列为SH-T₁₀-GCTGAGGTT-Fc，如序列4所示；DNA步行者探针浓度为5~15 μM，保护探针的浓度为5~15 μM，步行者探针与保护探针的体积比为1:1；水浴杂交温度为90~100 ℃，杂交时间为4~6 min；杂交双链与信号探针的摩尔比为1:15~25；TCEP的浓度为5~15mM，与信号探针的体积比为1:(2~3)；还原反应时间为0.5~1.5 h。

5.根据权利要求1所述的基于DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，强导电性的磁性纳米复合物溶液的浓度为9~11 mg/mL，混合探针溶液与强导电性的磁性纳米复合物溶液的体积比为(40~50):10，反应时间为6~12 h。

6.一种根据权利要求1~5任意一项所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物的制备方法制备得到DNA步行者偶联的磁性纳米复合物。

7.一种根据权利要求6所述的DNA步行者偶联的磁性纳米复合物在检测miRNA中的应用。