[发明专利]一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括核酸释放剂、反应液、对照品、标准品、内标，所述的核酸释放剂由KOH、十二烷基硫酸锂或十二烷基硫酸钠、吐温20组成，溶剂为无核酶的去离子水。本发明提供了一种高效快速检测及定量血清或血浆中肝炎病毒核酸的方法，其中的核酸释放剂能够高效快速释放血清(或血浆)中各种形态的核酸，然后直接加入反应液即可进行检测，配方简单，对核酸扩增无污染影响，检测结果准确，既能检测DNA,也能检测RNA，对不同复杂程度的核酸更具普适性，轻松地解决了大多数复杂模板扩增困难的问题。

技术领域

本发明涉及生物医学临床分子诊断和动物防疫分子诊断，提供一种试剂盒及其方法，高效快速检测及定量人及动物血清(或血浆)中特定的病原微生物及其他特定的游离核酸分子。

技术背景

很多病原微生物的筛查和诊断，是通过检测血清或者血浆中的病原微生物，比如人类血筛的DNA病毒主要为HAV、HBV、HCV、HIV、梅毒螺旋体菌、EB病毒、CMV、新生儿肠道DNA病毒等。在动物防疫方面，比如ASFV、PDCoV、高致病性猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒等，都可以对血清或血浆进行检测及定量。传统的免疫学和微生物等方法检测各种病原微生物，其缺点是灵敏度低、窗口期长。目前核酸分子检测技术得到了很好的发展，其灵敏度高、特异性好、能定量，而且极大的缩短了检测的窗口期。当前常用的荧光定量PCR技术，是先将样品中的核酸提取出来，再对提取出来的核酸进行检测及诊断。但是核酸提取过程复杂、耗时长，且容易产生污染，而且需要消耗大量试剂及其它耗材。

通常，荧光定量PCR检测DNA、RNA所用的模板是纯化好的核酸，核酸从复杂样品中纯化出来需要经过繁琐的操作，从而将核酸从杂质中释放、纯化出来，避免杂质随核酸进入PCR体系进而抑制PCR。不同的样品类型，杂质类型的复杂程度及含量都不同。常见的杂质有胆酸盐、复杂多糖、胶原质、血红素、血色素、各种离子、蛋白质类、脂类等，这些杂质对PCR产生严重的抑制，需要经过繁琐的操作步骤将杂质去除。核酸的提取过程，一般需要经过：裂解样品释放核酸→核酸沉淀出来或释放的核酸被固体介质吸附→吸弃杂质→洗涤液洗涤，吸弃洗涤液(多次操作)→洗脱液从介质上洗脱核酸，最终才能得到纯度比较高的核酸，该过程涉及液体的多次转移，操作复杂，耗时长，易产生污染，效率低下，且需要大量试剂及其它耗材。其中核酸释放剂和反应液是影响核酸定量和快速检测结果的主要因素。

核酸的纯化原理无外乎是裂解试剂裂解样品释放出核酸，然后加入有机溶剂使核酸沉淀出来或者吸附于固体介质，再吸弃上清液(废液)，再多次用洗涤液洗涤核酸，最后用溶解液溶解沉淀的核酸或将核酸从固体介质上洗脱下来。目前市场上，核酸纯化试剂盒从纯化方式上大体可以分为三类：离心沉淀抽提、纯化柱法、磁珠法，纯化柱法、磁珠法的核酸提取试剂盒使用的比较广泛，因为柱提、磁珠法可以获得纯度比较高的核酸。但不管是纯化柱法还是磁珠法，其过程涉及液体的多次转移，操作复杂，耗时长，易产生污染，效率低下，且需要大量试剂及其它耗材。

荧光定量PCR技术中最关键的就是要预防核酸的污染，避免出现假阳性结果，特别是要防止扩增产物对PCR的污染。由于PCR有着高效的扩增效率，其扩增产物的浓度是初始浓度的几百万倍，一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。由于UV照射对500bp以下的DNA片段的去污效果不好，而分子诊断扩增的片段在200bp左右，UV照射不能有效清除分子诊断扩增带来的污染问题。

目前市场上，有很多核酸检测试剂盒，而且很多已经应用于医学临床诊断、防疫、食品安全领域。而目前市场上的核酸检测试剂盒绝大部分是需要经过复杂的核酸提取纯化过程，然后再进行PCR检测。针对目前核酸检测试剂盒的诸多缺陷，急需改进核酸检测技术，研发一款操作简单、污染可能性低、耗时短、效率高、灵敏度高、试剂及其耗材消耗量少的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒及其检测方法。

本发明的高效快速检测及定量血清或血浆核酸的试剂盒，包括核酸释放剂、反应液、对照品、标准品、内标，