[发明专利]一种大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒引物组为基于O8、O9血清型大肠杆菌的O抗原合成相关基因所设计的2对特异性引物。本发明所述含该引物组的检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌O8、O9血清分型检测方法上的不足，可以满足当前大肠杆菌O8、O9血清型分型的检测需求，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌O8、O9血清型鉴定的PCR引物组、检测方法及包括该引物组的双重PCR检测试剂盒。

背景技术

大肠杆菌是大肠埃希氏菌（ Escherichia coli,  E.  coli）的俗称，属于肠杆菌科（ Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（ Escherichia）。自然界中大肠杆菌种类很多，其中绝大多数是非致病性大肠杆菌，但某些特殊血清型具有致病性，可以引起人或动物的腹泻、泌尿道感染、肺炎、败血症、心内膜炎、幼儿脑炎，家禽的卵黄性腹膜炎、肉芽肿等病症。大肠杆菌抗原复杂，主要有菌体抗原（O）、荚膜抗原（K）、鞭毛抗原（H）和菌毛抗原（F）等，是血清型鉴定的物质基础，其中O抗原又作为大肠杆菌最为常用的分型抗原。目前已知大肠杆菌O抗原有180多种，可用单因子抗O血清做玻板或试管凝集试验鉴定。然而，血清凝集试验存在诸多不足，如交叉反应比较严重、假阳性多、自凝现象严重、敏感性低等。因此，实现大肠杆菌血清型的快速有效检测，对于大肠杆菌鉴定具有重要的作用。

大肠杆菌O抗原合成相关基因簇主要编码O抗原合成、翻转及运输相关蛋白，包括糖基转移酶、乙酰基转移酶、多糖聚合酶及翻转酶。由于不同血清型大肠杆菌编码的O抗原不同，其O抗原合成相关基因簇的基因有所差别。因此，大肠杆菌O抗原合成相关基因可以作为血清型的诊断靶标。现在用于检测的分子生物学方法主要包括聚合酶链反应（PCR）方法、基因芯片技术等。基因芯片技术对于样品的要求比较高，且需要根据不同需求定制，花费较高，不太适用于兽医临床使用。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用于基因扩增、鉴别诊断等方面。目前，已有报道针对O抗原合成相关基因簇的基因设计引物进行大肠杆菌O1、O2、O6、O15、O18、O78、O45、O55、O114、O174、O177等血清型鉴定。O8、O9血清型大肠杆菌是危害养殖业的常见血清型，但是不同地区的优势血清型存在差异，给流行病学调查及疫病防控带来了困难。目前，仅有传统的血清凝集检测方法，其存在诸多缺点，尚没有针对O8、O9血清型的快速检测及鉴别诊断PCR方法。因此，迫切需要一种高效、快速的检测方法用于区分鉴定O8、O9血清型，对大肠杆菌的流行病学调查、大肠杆菌病的精准诊断及疫病防控具有重要意义。

发明内容

针对现有大肠杆菌血清型分型方面存在的问题，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一个目的是提供了一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测大肠杆菌O8、O9血清型的引物组，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分别为：

O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’ (SEQ ID NO.1)

O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’ (SEQ ID NO.2)

09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’ (SEQ ID NO.3)

O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’ (SEQ ID NO.4)