[发明专利]一种大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1. 一种大肠杆菌O8、O9血清型双重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的体积各为1.0μL；

所述引物核苷酸序列分别为：

O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’，SEQ ID NO.1，

O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’，SEQ ID NO.2，

09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’，SEQ ID NO.3，

O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’，SEQ ID NO.4；

大肠杆菌O8、O9血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为208bp和326bp。

2.一种非诊断目的的检测大肠杆菌O8、O9血清型的双重PCR检测方法，其特征在于，先将待测大肠杆菌制备PCR模板，用检测大肠杆菌O8、O9血清型的引物组中的正向引物O8-F、O9-F和反向引物O8-R、O9-R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型，出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型，

所述引物的核苷酸序列分别为：

O8-F：5’-CAGGCACGCTATCAAACTAG-3’，SEQ ID NO.1，

O8-R：5’-CGCTCTGACCTTTATCCAGCA-3’，SEQ ID NO.2，

09-F：5’-GTACGTTACTGAAGCTGCTG-3’，SEQ ID NO.3，

O9-R：5’-GAGCGCTTCATCGACGATCA-3’，SEQ ID NO.4；

大肠杆菌O8、O9血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为208bp和326bp；所述方法包括下列步骤：

1）大肠杆菌模板的制备

将待检大肠杆菌菌株接种至LB液体培养基，在温度为37℃的条件下培养过夜得到细菌培养液，即得到可以用做PCR模板的菌液；

2）特异性引物的制备

引物O8-F、O9-F和O8-R、O9-R的使用浓度为10pM；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；

3）PCR反应体系的建立和扩增

取PCR管，分别加2×PCR PreMix的体积为10.0μL，引物O8-F、O8-R和O9-F、O9-R的体积各为1.0μL、模板1.0μL、超纯水5.0μL，混匀；PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃ 45s，50℃30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；

4）PCR检测结果判定与表述

取10μL PCR产物，点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现208bp条带为大肠杆菌O8血清型,出现326bp条带为大肠杆菌O9血清型。