[发明专利]一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途

说明书

本发明提供了一种双价支气管炎核酸疫苗、制备方法及用途，其核心表达区仅为1491bp，序列前引入了分泌信号肽，表达序列引入Kozak序列，并选用含有禽启动子序列质粒，去除了不易成为抗原的疏水区，采用M41和H120特征蛋白拼接，中间连有lingker序列，可刺激产生针对两种毒株的中和抗体，弥补了传染性支气管炎病毒免疫交叉性差的弱点；选用鼠伤寒沙门氏菌作为载体，对宿主本身没有感染隐患，但可支持核酸疫苗长期表达，以达到长期免疫效果；疫苗的免疫方式为经口免疫，可以添加到饲料内，使用方便优于滴鼻或注射免疫方式；该疫苗制备为发酵后收集培养物直接作为疫苗，减少了蛋白纯化，除内毒素等步骤，节约了成本有利于大规模生产。

技术领域

本发明属于动物疫苗抗原制备技术领域，涉及一种双价禽类传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法及其免疫用途。

背景技术

传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)感染引起的一种鸡的急性、高度接触传染性呼吸道传染病。该病毒属于冠状病毒科，冠状病毒属的单股正链RNA病毒，病毒粒子带有囊膜和纤突，含有纤突(S)，膜(M)糖蛋白及内部核衣壳(N)蛋白等三种蛋白，感染后以咳嗽、喷嚏和气管啰音为主要临床表现，可出现产蛋下降，肾病理性肿大，尿酸盐沉积等。其中，雏鸡病死率可达10％～30％，目前临床无有效治疗方式，主要以疫苗预防为主，国内已上市的多为H120和H52鸡胚适应株制备的弱毒苗，而国外多国已分离的毒株多与马萨诸塞株(M41株)相似，已上市了M41株灭活苗，但其受制于流行株多而复杂，各血清型交叉免疫性差等因素的影响，其临床保护效果均非常有限；目前制备疫苗的手段还包括亚单位疫苗或核酸疫苗，但亚单位疫苗需要表达纯化，再进行免疫，具有步骤繁杂，较难去除发酵表达过程中产生的内毒素的问题，现有的核酸疫苗也具有需提纯后再滴鼻免疫以及抗原表达量低，特异性差等缺点，本发明由此而来。

发明内容

基于当前对寻找预防家禽传染性支气管炎药物的迫切需求，本发明为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗，其氨基酸序列包含：

1)流感病毒血凝素信号肽；

2)M41株S1蛋白部分氨基酸序列；

3)连接12氨基酸lingker；

4)H120株S1蛋白部分氨基酸序列。

进一步的，所述核酸疫苗的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述核酸疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述核酸疫苗选用鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)作为质粒载体。

进一步的，所述核酸疫苗中含有有鸡β-actin启动子的PCAGGS表达质粒。

进一步的，所述核酸疫苗表达序列插入到PCAGGS载体的1718bp碱基ECORI酶切位点及1810bp碱基BgiII酶切位点之间位置。

进一步的，所述核酸疫苗经过密码子适应性优化后，前端加入了Kozak序列ACCACCATGGCC，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种双价传染性支气管炎核酸疫苗的制备方法，其步骤包括：