[发明专利]DNA纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法

说明书

本发明公开了一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0 DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度。本发明检测方法过程简单，能够一次性同时检测多种待测转录因子，实现了多目标检测，在多通路检测中获得良好的检测结果，本发明检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析，提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及分析技术检测领域，更具体地，涉及一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。

背景技术

转录因子(Transcription factors，TFs)是细胞中的一种调控蛋白，通过与基因中的DNA顺式作用元件结合，来启动和调节基因的转录过程。与此同时，也有大量研究指出，转录因子的非正常表达与活化，广泛的存在于人体的病理过程，这些病理过程包括癌症的产生与转移、病毒感染、自身免疫疾病等。因此转录因子既可以作为一种潜在的诊断标志物，又可以成为临床治疗的靶点。然而，对TFs传统的检测技术通常为免疫印迹法、DNA足迹法、核染色质免疫共沉淀等方法，这些方法存在检测过程较为繁琐、效率低下，应用面窄，无法实现多目标检测的技术问题，导致TFs作为诊断指标在临床上的应用尚不成熟。综上所述，实现快速、灵敏、低成本、多重检测转录因子是现在的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足，提出一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。本发明检测方法过程简单，能够一次性同时检测多种待测转录因子，实现了多目标检测，在多通路检测中获得良好的检测结果，本发明检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析，有效的提高了检测效率。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度。

所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种。

该方法包括以下步骤：

(1)掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，冷却至室温后，与磁珠进行孵育，得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠；用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，并添加45nM待测转录因子对应的掩蔽链，孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；所述柠檬酸缓冲液的PH为7.4，待测转录因子对应的掩蔽链的添加量为100uL；

(2)等温扩增：将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应80-100分钟，然后再加热至85℃反应5-15分钟，终止后离心，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；其中，Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液体积均为10uL；

(3)HPLC分析：将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测；高效液相色谱检测的条件为：流动相A为醋酸己铵溶液，固定相B为乙腈；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B。