[发明专利]DNA纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法

权利要求书

1.一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，

其特征在于，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0 DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度；所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种；所述探针、掩蔽链，扩增模板的序列如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，冷却至室温后，与磁珠进行孵育，得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠；用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，并添加45 nM待测转录因子对应的掩蔽链，孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；

（2）等温扩增：将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0 DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应80-100分钟，然后再加热至85℃反应5-15分钟，终止后离心，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；

（3）HPLC分析：将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测；高效液相色谱检测的条件为：流动相A为醋酸己铵溶液，固定相B为乙腈；梯度洗脱条件为：梯度从31%B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33%B，15-20分钟为38%B，21-24分钟为41%B。

3.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（1）中，孵育的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟；孵育混匀的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟。

4.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述对应DNA信号的扩增模板为100nm。

5.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的Nt.BstNBI核酸内切酶浓度为2-8 u/μL，Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为0.5-1.5 u/μL，dNTPs混合物浓度为50-150μM。

6.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（2）中，离心条件为以8000-15000转/分离心1-5分钟。

7.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述高效液相色谱分析的色谱柱为C18柱，采用的色谱温度为60℃；紫外检测波长为260nm。

8.根据权利要求2所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述醋酸己铵的浓度为100 mM，pH值为7.0。