[发明专利]用于目标互补DNA富集的方法

说明书

本发明提供了用于富集目标互补DNA(cDNA)的方法，包括：(a)提供多个cDNA，每个cDNA在末端包含第一通用序列，并且其中所述多个cDNA包含目标cDNA；(b)用与第一通用序列互补的通用正向引物和基因特异性反向引物扩增目标cDNA，且其中通过核酸扩增反应、通过连接或通过引物延伸反应将第二通用序列添加到与第一通用序列相反的目标cDNA的末端；(c)使用通用正向引物和与第二通用序列互补的通用反向引物扩增所述扩增子或延伸产物。在一个实施方式中，通用正向引物、基因特异性反向引物和第二通用反向引物在相同的反应混合物中提供，使得扩增是单一步骤。

相关申请

本申请要求于2018年12月28日提交的美国临时专利申请第62/785,916号的优先权，上述申请的全部教导通过引用并入本文。

发明背景

富集样品中特定的核苷酸或蛋白质的能力对于分子生物学研究和医学应用都很重要。特别是，在单细胞RNA测序中有获得特定基因的序列信息或标签计数的特定需求。

发明概述

本发明提供了用于富集目标互补DNA(cDNA)的方法。

在各个方面，本发明提供了富集目标cDNA的方法，其包括以下步骤：

(a)提供多个cDNA，其中每一个cDNA在末端包含第一通用序列，并且其中多个cDNA包含待富集的目标cDNA；

(b)提供第一反应混合物，包含：

至少一个基因特异性引物(例如，至少一种基因特异性反向引物)，其包含与目标cDNA中序列的全部或一部分互补的序列，并且在至少一个基因特异性引物的末端进一步包含至少一个第二通用序列；

(c)将多个cDNA与第一反应混合物接触，使得至少一个基因特异性引物与目标cDNA杂交；

(d)延伸至少一个基因特异性引物以获得至少一个延伸产物；

(e)提供第二反应混合物，其包含：

1)通用寡核苷酸正向引物，其包含与第一通用序列的全部或一部分互补的序列；和

2)通用寡核苷酸反向引物，其包含与所述至少一个第二通用序列的全部或一部分互补的序列；

(f)使至少一个延伸产物与第二反应混合物接触；和

(g)扩增至少一个延伸产物，从而富集目标cDNA。

在进一步的方面，本发明提供了富集目标互补DNA(cDNA)的方法。该方法一般地包括以下步骤：

(a)提供多个不同的cDNA，其中每一个cDNA在末端包含第一通用序列，并且其中多个cDNA包含待富集的目标cDNA；

(b)提供第一反应混合物，其包含：

1)通用寡核苷酸正向引物，其包含与第一通用序列的全部或一部分互补的序列，和

2)至少一个基因特异性反向引物，其中所述至少一个基因特异性反向引物包含与目标cDNA中序列的全部或一部分互补的序列，并且在至少一个基因特异性引物的末端进一步包含至少一个第二通用序列；

(c)使多个cDNA与第一反应混合物接触；

(d)扩增目标cDNA以获得扩增子；

(e)提供第二反应混合物，其包含：

1)通用寡核苷酸正向引物，其包含与第一通用序列的全部或一部分互补的序列，和