[发明专利]用于目标互补DNA富集的方法

权利要求书

1.一种富集目标互补DNA(cDNA)的方法，包括以下步骤：

(a)提供多个不同的cDNA，其中每个cDNA在末端包含第一通用序列，并且其中所述多个cDNA包含待富集的目标cDNA；

(b)提供第一反应混合物，其包含：

1)包含与所述第一通用序列的全部或一部分互补的序列的第一通用寡核苷酸正向引物，和

2)至少一个基因特异性反向引物，其中所述至少一个基因特异性反向引物包含与所述目标cDNA中序列的全部或一部分互补的序列，并且在所述至少一个基因特异性引物的末端进一步包含至少一个第二通用序列；

(c)使所述多个cDNA与所述第一反应混合物接触；

(d)扩增所述目标cDNA以获得扩增子；

(e)提供第二反应混合物，其包含：

1)包含与所述第一通用序列的全部或一部分互补的序列的第二通用寡核苷酸正向引物，和

2)通用寡核苷酸反向引物，其中所述通用寡核苷酸反向引物包含与所述至少一个第二通用序列的全部或一部分互补的序列；从而富集所述目标cDNA；

(f)使所述扩增子与所述第二反应混合物接触；和

(g)扩增所述扩增子，从而富集所述目标cDNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个cDNA中的每一个cDNA还包含细胞识别标签或独特的分子标识符(UMI)序列，或其组合。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞识别标签或UMI序列或其组合还包含聚(T)序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列位于每一个cDNA分子的5'末端。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列位于每一个cDNA分子的3'末端。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中通过逆转录来自单个细胞的mRNA获得所述多个cDNA。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在(d)中扩增所述目标cDNA包括通过聚合酶链反应进行扩增。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一个基因特异性反向引物还包含通过RNA碱基与所述引物分隔开的封闭结构域。

9.如权利要求8所述的方法，其中(d)中扩增所述目标cDNA包括通过RNase H依赖性聚合酶链反应进行扩增。

10.如权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述细胞识别标签或所述UMI序列或其组合在所述目标cDNA扩增后被保持。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，还包括使用所述通用寡核苷酸正向引物、所述通用寡核苷酸反向引物、所述至少一个基因特异性反向引物或其组合对所述目标cDNA的一个或多个部分进行测序。