[发明专利]用于形成连接产物的方法和组合物

说明书

在一些方面，本公开提供了无需富集单链多核苷酸而形成包含单链多核苷酸的连接产物的方法。通过本公开的各个方面形成的连接产物可用于多种应用，包括但不限于序列分析。在一些实施方案中，所述连接产物包含无细胞多核苷酸。在一些方面，本公开提供了与本文方法一致的反应混合物、试剂盒和复合物。

交叉引用

本申请要求2018年6月12日提交的第62/684,057号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

背景技术

形成多核苷酸连接产物可具有多种用途，如检查靶多核苷酸、用来生成表达载体的分子克隆方法、cDNA文库构建以及作为扩增和测序反应的前置步骤。在许多情况下，用于分析、分子克隆和其他过程的靶多核苷酸存在于包含多核苷酸的不均匀混合物的核酸样品中。选择性形成包含在多核苷酸的不均匀混合物中存在的靶多核苷酸的连接产物可能是优选的。

然而，缺乏进行选择性形成连接产物的有效方法，例如对于包含随机片段DNA如无细胞DNA的靶多核苷酸而言。现有的选择性形成连接产物的方法可能具有效率低、产率低和工作流程繁琐的缺点。

发明内容

鉴于上述情况，对利用单链多核苷酸靶标生成连接产物的改进方法存在需求。本公开的方法和组合物满足了这一需求，并且还提供了额外的益处。

在一个方面，本公开提供了一种形成包含单链样品多核苷酸的连接产物的方法，其中所述单链样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：(a)将所述单链样品多核苷酸、第一单链衔接子、第二单链衔接子、第一桥联探针和第二桥联探针混合以形成多核苷酸复合物，其中所述多核苷酸复合物包括(i)通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交的第一桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第一桥联探针的3’端特异性杂交的单链样品多核苷酸的5’端，以及(ii)通过序列互补性与所述单链样品多核苷酸的3’端特异性杂交的第二桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第二桥联探针的3’端特异性杂交的第二单链衔接子的5’端；(b)(i)将第一单链衔接子的3’端连接至所述单链样品多核苷酸的5’端，并且(ii)将所述单链样品多核苷酸的3’端连接至第二单链衔接子的5’端；以及(c)降解或选择性地去除所述第一和第二桥联探针，从而形成连接产物。

在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含无细胞DNA。在一些实施方案中，所述无细胞DNA包含序列变体。在一些实施方案中，所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含具有至少一个拷贝的无细胞DNA序列或其互补序列的线性多联体。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含基因组DNA或其片段。

在一些实施方案中，所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸的5’端的区段不与所述第一桥联探针特异性杂交，并且所述区段形成第一单链环。在一些实施方案中，在(b)中的连接之前，将所述第一单链环切除。在一些情况下，不切除该环。在一些实施方案中，所述第一桥联探针的区段不与所述靶多核苷酸的5’端特异性杂交，并且所述区段在所述多核苷酸复合物中形成第一单链环。

在一些实施方案中，所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸的3’端的区段不与所述第二桥联探针特异性杂交，并且所述区段形成第二单链环。在一些实施方案中，在(b)中的连接之前，将所述第二单链环切除。在一些情况下，不切除该环。在一些实施方案中，所述第二桥联探针的区段不与所述靶多核苷酸的3’端特异性杂交，并且所述区段在所述多核苷酸复合物中形成第二单链环。