[发明专利]用于分配起源组织的无细胞核酸样品的羟甲基化分析及相关使用方法

说明书

提供了用于对样品中的核酸，例如获自人类受试者的无细胞流体样品中的DNA概率性分配起源组织的方法。为样品DNA生成羟甲基化概况，然后在羟甲基化概况向量的参考数据集中进行比较，其中每个羟甲基化概况向量鉴定在特定参考基因座处的羟甲基化概况，与该参照基因座相关的组织特异性基因以及与基因和参考基因座相关的组织。可以使用比较结果对样品核酸概率性分配起源组织。还提供了其他使用方法。

技术领域

本发明总体上涉及生物技术，并且更具体地涉及无细胞DNA的表观遗传学分析的应用。本发明可用于基因组学、医学、诊断学和表观遗传学研究领域。

背景技术

在与医学有关的许多领域，例如诊断学、治疗学和患者监测中，持续需要更精确的分析生物样品并从那些分析中提取有用的信息的方法，准确性和效率的目标常常是竞争的。分析方法应适用于高速处理和自动化，快速且经济高效地产生必要的结果，并提供高灵敏度和特异性。此外，通过分析方法提供的信息应发挥最大作用。例如，在用于分析患者DNA的方法中，如果该方法能够快速提供足以诊断病理状态存在的信息，则它将是理想的。

最近，表观遗传学(epigenetics)领域的研究人员提出了一种测试，其中使用患者DNA的甲基化状态来确定DNA源自特定组织或器官的可能性。参见，例如，Sun et al.(2015)Proc.Natl.Acad.Sci.112(40)：E5503-E5512，其描述了使用全基因组范围的亚硫酸氢盐测序来生成各种组织的甲基化概况(methylation profile)，和Kang et al.(2017)GenomeBiology 18:53，其描述了使用DNA甲基化模式来鉴定肿瘤来源的DNA的起源组织(tissueof origin)。

无细胞DNA分析是一种相对较新的现象，具有无创性的优势，无需手术即可进行患者样品评估。然而，无细胞DNA分析也提出了独特的挑战，特别是因为无细胞DNA样品非常小且每毫升血浆中通常仅包含几纳克DNA。当将无细胞DNA与表观遗传分析结合使用时，问题更加复杂，其中，需要检测相对罕见的DNA修饰，例如5-甲基胞嘧啶和甚至更稀有的5-羟甲基胞嘧啶。

因此，在本领域中存在对适用于无细胞DNA的表观遗传学分析方法的持续需求，其中所提供的信息包括特定基因体(gene body)或其片段的起源组织或器官。

发明内容

随着表观遗传学领域的进展，已经证明稀有的DNA修饰5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的检测与甲基化类似物即5-甲基胞嘧啶的检测潜在同样重要：

取决于组织类型，5hmC的发生频率比5mC的发生频率低得多，比率通常约为10:1(参见Nestor et al.(2012)Genome Biology 13：R84)，其中5mC占所有DNA碱基的大约1％。亚硫酸氢盐测序不能区分5mC和5hmC，因此，需要其他方法单独检测5mC和5hmC残基。由于5hmC出现频率远低于5mC，因此检测5hmC的任何方法都需要展现出相对于鉴定的所有5hmC残基的级份而言的高效率，以及高选择性，这意味着实质上所有鉴定为5hmC的残基都应实际上是5hmC残基。尽管已经确定5hmC参与了多种过程，包括转录，DNA去甲基化，以及在异常5hmC模式的情况下参与肿瘤发生，但5hmC的分子功能才刚刚开始被理解。参见Tahilianiet al.(2009)Science 324(5929):930-035(2009)；Guo et al.(2011)Cell 145:423-434；Wu et al.(2011)GenesDevelopment 25:679-684；Ko et al.(2010)Nature 468:839-843；和Robertson et al.(2011)Biochem.Biophys.Res.Comm.411(1):40-3。还已知5hmC是稳定的DNA修饰，是由10-11易位(Ten-Eleven Translocation，TET)酶(例如TET1)催化5mC氧化而形成的。