[发明专利]蛋白质-多核苷酸缀合物的检测测定

说明书

本发明涉及检测和定量各种样品基质中的完整蛋白质‑多核苷酸缀合物分子的方法。特别地，所述方法利用三链体形成型寡核苷酸与蛋白质特异性结合伴侣组合以分别检测所述缀合物分子的多核苷酸和蛋白质组分。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月7日提交的美国临时申请号62/681,931的权益，将其通过引用以其全部内容并入本文。

电子提交的文本文件的说明

本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且将其通过引用以其整体特此结合。2019年5月23日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A-2248-WO-PCT_SeqList_ST25，并且大小为1.7千字节。

技术领域

本发明涉及药物缀合物分子的检测和定量。特别地，本发明涉及在基于夹心的测定中使用带标签的三链体形成型寡核苷酸和蛋白质特异性结合伴侣来检测和定量样品中完整的蛋白质-多核苷酸缀合物分子的方法。

背景技术

核酸分子一直代表着一类有前途的治疗剂。然而，已证明将治疗性核酸分子递送至靶组织是具有挑战性的，并且已经尝试了各种方法。一种这样的递送方法需要治疗性核酸分子与靶向蛋白的缀合，所述靶向蛋白特异性结合目的细胞类型上表达的细胞表面蛋白。因此，这些蛋白质-多核苷酸缀合物分子，例如抗体-siRNA缀合物，正在作为一种新的治疗方式出现。因此，重要的是要具有能够检测和定量完整蛋白质-多核苷酸缀合物分子的稳健测定方法。

尽管有一些现有的方法可以适用于检测完整的蛋白质-多核苷酸缀合物分子，但它们具有许多缺点。例如，尺寸排阻色谱法可用于从溶液中的其他物质分离完整的蛋白质-多核苷酸缀合物分子。然而，该方法在很大程度上是定性的，并且需要高水平的样品纯度，并且因此不适用于复杂的样品基质，例如血清和组织匀浆。其他方法，例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、液相色谱-质谱(LC-MS)和核磁共振(NMR)需要能影响缀合物分子完整性的条件或样品处理或测定后数据解释的多个耗时步骤。而且，这些方法都与复杂样品基质中缀合物分子的检测或定量方法不兼容，因为通常需要高纯度的样品。

已经报道了一种抗体-siRNA缀合物分子的检测方法，所述方法利用基于抗原的捕获步骤然后进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)(Tan等人,Analytical Biochemistry[分析生物化学],第430卷:171-178,2012)。但是，此方法高度依赖于PCR引物和探针杂交的效率，所述效率会受到siRNA分子中存在的经化学修饰核苷酸的数量和类型的影响。而且，PCR步骤需要使用高温(例如85℃或更高)，这可能导致蛋白质降解，从而潜在地限制了在更复杂的样品基质(例如组织匀浆)中该测定的使用。

因此，本领域需要开发简单的测定，其能够对跨多种样品类型(包括复杂生物样品)的完整蛋白质-多核苷酸缀合物分子进行检测和定量。

发明内容

本发明提供了用于检测和定量各种样品基质中的蛋白质-多核苷酸缀合物分子的方法，所述样品基质包括复杂的生物样品，例如血清和组织匀浆。在一个实施例中，所述方法包括使样品与跟标签共价连接的三链体形成型寡核苷酸(TFO)在允许TFO与缀合物分子中的多核苷酸杂交的条件下接触，从而形成杂交混合物；使所述杂交混合物与包含捕获试剂的表面接触，所述捕获试剂与共价连接至TFO的标签特异性结合；使所述表面与检测试剂接触，其中所述检测试剂包含与结合伴侣偶联的可检测标记，所述结合伴侣特异性结合缀合物分子中的蛋白质；并检测来自可检测标记的信号。

在一个实施例中，所述方法包括使样品与跟与标签共价连接的TFO在允许TFO与缀合物分子中的多核苷酸杂交的条件下接触，从而形成杂交混合物；使所述杂交混合物与包含捕获试剂的表面接触，所述捕获试剂与缀合物分子中的蛋白质特异性结合；使所述表面与检测试剂接触，其中所述检测试剂包含与结合伴侣偶联的可检测标记，所述结合伴侣特异性结合与TFO共价连接的标签；并检测来自可检测标记的信号。