[发明专利]聚底物及其使用方法

说明书

公开了聚底物以及聚底物在核酸测序中的用途。在一示例中，一种聚底物包括聚合物分子，附着于该聚合物分子的多个底物分子以及附着于该聚合物分子的结合部分，其中该底物分子是发光酶底物；并且其中结合部分特异性结合至引物延伸产物的3'末端核苷酸或第二结合部分，并且第二结合部分特异性结合至引物延伸产物的3'末端核苷酸。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年5月11日提交的美国临时申请No.62/670,627的优先权权益，其全部内容通过引用合并于此。

背景技术

对用于核酸测序和重测序的低成本、高通量方法的需求导致了“大规模并行测序”(MPS)技术的发展。一种常用的DNA测序方法称为“合成测序”(SBS)。参见Blackburn etal.,Curr.Genomics 16(3):159-174(2015)；Stranneheim and Lundeberg,Biotechnol.J.7:1063-73(2012)；和Guo et al.,Acc.Chem.Res.43:551-563(2010)。

SBS需要与被测序的寡核苷酸或DNA模板相对的受控(即每次一个)的正确互补核苷酸的掺入。这使得在每次一个地对每个核苷酸残基进行测序时能通过在多个循环中添加核苷酸来进行精确测序，因此可以防止发生一系列不受控制的掺入。在一种方法中，可逆终止子核苷酸(RT)用于确定DNA模板的序列。在最常用的SBS方法中，每个RT都包含修饰的核苷酸，该核苷酸包括(1)保护基团，该保护基团确保DNA聚合酶只能将单一碱基添加到生长中的DNA复制链的3'末端，以及(2)可以被照相机检测到的荧光标记。在最常见的SBS方法中，将模板和测序引物固定在固体支持物上，并将该支持物暴露于四种DNA核苷酸类似物的每一种和DNA聚合酶中，每种类似物均包含通过可裂解接头连接至含氮碱基的不同荧光团以及3'-脱氧核糖的3'-OH位置处的O-叠氮甲基。只有正确的互补碱基退火至靶标，然后才能在引物的3'末端掺入。洗去未掺入的核苷酸并使固体支持物成像。引入TCEP(三(2-羧乙基)膦)以裂解连接基并释放出荧光团，并去除3'-O-叠氮基甲基，从而再生出3'-OH。然后可以重复该循环(Bentley et al.,Nature 456,53–59,2008)。四种碱基中的每种碱基均使用不同的荧光颜色标记，使得在测序的每个循环中，可以通过其颜色识别所掺入的RT的身份。

尽管SBS的广泛使用，仍需要改进。例如，当前的SBS方法需要昂贵的可逆终止的dNTP(RT)，其碱基上的标签(例如染料)通过可裂解的接头连接，从而导致a)标记裂解后留在掺入碱基上的化学疤痕，b)效率较低引入，c)淬灭，d)激发的染料诱导延伸终止，并在每个测序循环中减少信号。

附图说明

图1是本发明的测序方法的示例性实施方案的图示。图1A显示了聚底物(PS)。图1B显示了引物延伸产物(PEP)，其中在生长链的3'末端掺入了dNTP。图1C显示了具有直接结合到生长链的3'末端的结合部分的PS。图1D显示了PS，该PS具有与生长链的3'末端间接结合的结合部分；PS结合部分与初级结合剂结合。图1E显示了其中结合部分是抗生蛋白链菌素(A)的PS。结合部分通过生物素亲和标记(B)与掺入的dNTP结合。图1F显示了在发光酶存在下底物分子的光发射。

图2是本发明测序方法的示例性实施方案的示意图。

图3是合成本公开内容的聚底物(例如，与荧光素共价结合的链霉亲和素标记的葡聚糖聚合物)的示例性方法的示意图。

图4A-4D是显示本公开的dNTP类似物的示例性3'保护基团的示意图。

具体实施方式

1.定义和术语