[发明专利]用于单分子测序的方法

说明书

本文中提供了用于利用聚合酶、模板核酸和包含用于发光反应的组分的聚合酶试剂溶液对单个核酸分子进行测序的方法和系统。

技术领域

本发明涉及用于单分子核酸测序的方法。

背景技术

当前的测序技术可以分为两个主要类别：短读段测序和长读段测序。在每种类别中，DNA被切割成长度高达一定数量的核苷酸或碱基对(bp)的片段。在所有情况下，所有DNA片段扩散成2维阵列并且由对应于至少一个传感器与DNA片段匹配的位置的传感器阵列检测。

短读段测序方法是包含连接法测序(SBL)和合成法测序(SBS)的简单的基于循环的技术。SBL方法包含SOLID(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))和Complete Genomics(BGI)。使用SOLID，实现约75个碱基对(bp)的读段长度，而使用Complete Genomics方法，28个到100个碱基对读段是可行的。使用这些方法，结构变异和基因组组装是不可能的，并且其易受均聚物误差的影响。其运行时间为约若干天。Illumina和凯杰(Qiagen)的GeneReader技术将SBS方法与循环可逆终止一起使用。它们可以达到高达300bp。然而，主要缺点是AT和GC富集区域的表示不足、取代误差和高半阳性率。另一方面，其它SBS方法(如454焦磷酸测序和Ion Torrent(赛默飞世尔科技公司)使用单核苷酸添加/终止。454焦磷酸测序可以达到400bp，而Ion Torrent可以实现700bp读段长度。然而，尽管这些技术更快速并且适用于床边检测(point of care)，但是它们也具有许多缺点，主要包含插入/缺失误差和均聚物区域误差。它们不能用于揭示远程基因组或转录组结构并且不能进行配对末端测序。

长读段测序方法包含两种主要类型：合成长读段测序或实时长读段测序。Illumina和10X Genomics所使用的合成拼接在一起的长读段测序聚焦于利用条形码进行文库制备并且允许大片段的计算组装。事实上，这些技术不执行实际的长读段，而是执行使用加条形码方法对DNA片段进行组织化的短读段，这有助于消除分析期间的一定复杂度，从而允许获得与实际长读段方法类似的数据。但是，部分地由于其需要更大的覆盖范围，所以这种方法的成本很高。长读段测序的另一种类型是实时长读段测序，所述实时长读段测序已由太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)和牛津纳米孔科技公司(OxfordNanopore Technologies)使用。与合成的长读段测序不同，实时长读段测序不依赖于经过扩增的DNA的克隆群并且不需要化学循环。纳米孔技术具有约30％的极高误差率，这还需要会显著地提高成本的极高覆盖范围。使用经过修饰的碱基对于纳米孔技术而言也已经特别具有挑战性，所述使用经过修饰的碱基已经产生使分析甚至更加复杂的独特信号。太平洋生物科学公司可以达到高达4000-5000bp的读段长度。然而，由于长读段的约15％的高单次通过误差率，因此需要高覆盖范围，这使得1Gb测序成本超过1000美元(参见例如，Goodwin等人,《自然评论遗传学(Nat.Rev.Genet.)》17:333-351；2016)。另外，这些方法所呈现的热背景和所利用的激发能量损害关键反应中所使用的DNA聚合酶，这最终限制这个技术的读段长度和适用性。另外，由于所产生的发光是独立于由聚合酶连接的核苷酸的通用光谱，所以焦磷酸测序需要基于循环的方法，在所述基于循环的方法中，一个接一个地施用每个核苷酸，从而从所有结合事件中收集信号。在这之后是洗涤循环以去除未结合的核苷酸，以便施用下一核苷酸。

由于大多数当前技术按单位提供核苷酸的短读段长度(约40-100个碱基长)，因此最具挑战性的问题之一在于将序列的小片段比对成一个有意义的大序列，并且分析高覆盖范围数据并使用功能强大的超级计算机对用复杂算法产生的数据的负载进行后处理。较新一代的基于单分子的测序技术可以潜在地解决这个问题。然而，这些现有技术中的每种现有技术都具有高误差率，从而通常需要约30X到100X的高覆盖范围(序列的相同区域的多个读段)以获得可靠的数据。

因此，需要用于单分子核酸测序的改进方法。

发明内容