[发明专利]一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括裂解缓冲液、蛋白酶K、转化剂、DNA保护剂、结合液、脱磺基液、漂洗液、洗脱液和磁珠悬液。该方法巧妙的将核酸提取和转化过程合二为一，省去了原核酸提取过程中的纯化过程，并结合简便的磁珠法对转化DNA进行纯化，大大节省了时间和材料，能够快速得到高转化率、高质量及高纯度的DNA，通过提取与转化工艺的调控，克服了转化步骤需高温完成的缺陷，可在温和恒定条件下进行转化，有利于甲基化检测的自动化和标准化，有利于后续细胞样本中的DNA的甲基化水平分析。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法。

背景技术

表观遗传学在肿瘤发生中的作用逐渐受到人们的重视。其主要表现形式有DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记、母体效应及RNA编等。DNA甲基化是表观遗传学的主要表现形式，是调节基因功能的重要机制，与维持细胞正常功能、遗传印记、基因沉默、生物胚胎发育调节及肿瘤的发生密切相关。DNA甲基化并不影响基因序列，但使基因表达受到一定影响，是转录抑制的主要机制。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。

DNA甲基化是将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)供给的甲基通过DNA甲基转移酶(DNMTs)作用添加到胞嘧啶(C)的5号碳原子上，胞嘧啶转化为5-甲基化胞嘧啶。DNA发生甲基化的主要位点是在基因启动子的CpG岛。癌症基因组中CpG岛内局部高甲基化话及全局基因组低甲基化现象是肿瘤细胞甲基化水平改变的主要表现。CpG岛局部高甲基化常引起调控细胞周期相关基因等抑癌基因和修复基因表达降低，而全局基因组低甲基化则是由于肿瘤细胞中DNA甲基化酶活性异常增高，或未甲基化的CpG岛局部掩护机制被毁坏，使5-甲基胞嘧啶脱失，激活原癌基因及转座子，增加染色体不稳定性，导致癌症发生。

检测DNA甲基化水平的方法很多，其中最常见的方法均基于DNA亚硫酸盐转化技术。通过重亚硫酸盐处理可将DNA中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，从而区分甲基化DNA与非甲基化DNA。再通过MSP、BSP、NGS等方法分析待检的DNA序列的哪些甲基化位点发生了甲基化。

目前市面上的大多数的重亚硫酸盐转化试剂盒的转化体系是一种高盐，高温和低pH值的条件，需要经过氢氧化钠变性、亚硫酸盐高温转化及脱磺酸基和脱盐等才能将DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。在此过程中，会导致DNA片段化以及发生严重的降解，导致转化后的PCR及后续分析技术的灵敏度降低。如专利CN201610013476.8、CN201010286647.7。并且大多商品化的试剂盒采用离心柱法进行产物纯化，部分试剂盒还需要carrier RNA，需要进行多次洗涤过程，造成DNA损耗高、回收效率下降，且难以实现自动化操作，限制了甲基化水平的研究和检测的应用。另外专利CN201711139273公开一种血浆DNA边提取边转化的方法，但是其同样没有克服需要高温转化这一问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，旨在开发一种将核酸提取过程和转化过程合二为一的高效、快速的实现核酸提取和转化的试剂盒。本发明巧妙的将核酸提取和转化过程合二为一，省去了原核酸提取过程中的纯化过程，并结合简便的磁珠法对转化DNA进行纯化，大大节省了时间和材料，能够快速得到高转化率、高质量及高纯度的DNA，通过提取与转化工艺的调控，克服了转化步骤需高温完成的缺陷，可在温和恒定反应条件下进行转化，为提高DNA甲基化分析准确性提供有效方法。

本发明的目的是提供一种一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法。

本发明另一目的是提供所述试剂盒的使用方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一步法核酸提取转化试剂盒，包括如下组分：裂解缓冲液、蛋白酶K、转化剂、DNA保护剂、结合液、脱磺基液、漂洗液、洗脱液和磁珠悬液；