[发明专利]一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种适用于细胞样本的一步法核酸提取转化试剂盒，包括如下组分：裂解缓冲液、蛋白酶K、转化剂、DNA保护剂、结合液、脱磺基液、漂洗液、洗脱液和磁珠悬液，其特征在于，其使用方法包括以下步骤：

(1)裂解：取细胞样本，加入裂解缓冲液、蛋白酶K、异丙醇和磁珠悬液进行裂解，涡旋振荡，60～70℃孵育15～20min，离心吸去上清液；

(2)洗脱：加入洗脱液I；

(3)转化：向步骤(2)所得混合液中加入转化剂和DNA保护剂，于60～68℃孵育45～90min；

(4)结合：向步骤(3)转化后的溶液中加入结合液，涡旋振荡，再加入磁珠悬液，涡旋振荡混匀后静置10～20min，期间每5min混匀颠倒1次，离心后置于磁性分离器上至溶液澄清，吸去上清液；

(5)纯化：

(51)漂洗：向步骤(4)产物中加入漂洗液对磁珠进行洗涤，涡旋振荡，离心，置于磁性分离器上至溶液澄清，吸去上清液；

(52)脱磺基：向步骤(51)产物中加入脱磺基液，旋涡振荡1～3min，室温静置15～20min，离心，置于磁性分离器上至溶液澄清，吸去上清液；

(53)漂洗：重复步骤(51)；

(54)干燥：室温静置10～15min待磁珠干燥；

(55)洗脱：加入洗脱液II，然后56℃、1000～1500rpm孵育10～15min，离心，将其置于磁力架2-5min，所得洗脱液即为纯化的DNA溶液；

其中，所述裂解缓冲液成分为0.03-0.06M的SDS、0.01-0.03M的乙二胺四乙酸二钠、0.02-0.04M的尿素、2-4M的盐酸胍、0.05-0.15M的三羟甲基氨基甲烷；

所述蛋白酶K的浓度为10-30mg/μL；

所述的磁珠悬液为含浓度40-60mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，具体为超顺四氧化三铁，且颗粒外表有表面修饰有羟基的二氧化硅包被；

所述洗脱液I成分为8-12mM的Tris-HCl缓冲液，pH8.0；

所述转化剂为5-7M的亚硫酸氢钠和0.6-0.9M的亚硫酸氢铵，pH在pH5.0～5.5；

所述DNA保护剂为25-35mM的对苯二酚；

所述结合液为6-8M的盐酸胍；

所述的漂洗液为0.05-0.2M的三羟甲基氨基甲烷和70-75％的无水乙醇，pH7～8；

所述的脱磺基液成分为0.4-0.6M的氢氧化钠和40-50％的无水乙醇；

所述洗脱液II成分为0.8-1.5M的Tris-HCl缓冲液和0.4-0.6M EDTA溶液，pH8.0±0.1。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，

所述裂解缓冲液成分为0.05M的SDS、0.02M的乙二胺四乙酸二钠、0.03M的尿素、3M的盐酸胍、0.1M的三羟甲基氨基甲烷；

所述蛋白酶K的浓度为20mg/μL；

所述的磁珠悬液为含浓度50mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，具体为超顺四氧化三铁，且颗粒外表有表面修饰有羟基的二氧化硅包被；

所述洗脱液I成分为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH8.0；

所述转化剂为6M的亚硫酸氢钠和0.8M的亚硫酸氢铵，pH在pH5.0～5.5；

所述DNA保护剂为30mM的对苯二酚；

所述结合液为7M的盐酸胍；

所述的漂洗液为0.1M的三羟甲基氨基甲烷和70％的无水乙醇，pH7～8；

所述的脱磺基液成分为0.5M的氢氧化钠和40％的无水乙醇；

所述洗脱液II成分为1M的Tris-HCl缓冲液和0.5M EDTA溶液，pH8.0±0.1。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，步骤(1)中细胞样本、裂解缓冲液、蛋白酶K、异丙醇和磁珠悬液的体积比为300-500：150-250：20-40：150-250：20-40。