[发明专利]一种壳聚糖酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A。本发明所用的壳聚糖酶突变体活性高，耐高温。并对该壳聚糖酶进行理性改造，通过定点突变和增加柔性片段的方法大大提高了其酶活及其热稳定性，使得该酶具有了工业化生产壳寡糖的潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基后的产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有生物可降解、对动物无毒害、可溶于酸性溶液、可获得多种物理形式并且更容易处理等特点。壳聚糖在多种领域都有应用，但一般制得的壳聚糖分子量都很大，而大分子壳聚糖不溶于水且不能发挥壳寡糖的一些特殊功能，因此，壳聚糖需要进一步通过化学法或酶法降解成壳寡糖。壳寡糖具有水溶性好、无毒性、与生物体兼容、环境友好型、易被生物体降解等特性，目前广泛用于医药卫生、保健食品、食品加工、化妆品、纺织、环保、农业、饲料等领域。

壳聚糖酶可以水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键，将壳聚糖降解。已发现的壳聚糖酶绝大部分为内切酶，可以将壳聚糖降解为壳寡糖。目前研究最多的是来源于细菌和真菌的壳聚糖酶。并且现阶段，制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。

酶法降解壳聚糖有诸多的优点，但是这种方法还是存在有待提高的方面，第一方面是壳聚糖酶的酶活力普遍较低；第二方面是酶的热稳定性有待提高。这两方面制约了酶法降解壳聚糖向大规模工业发展。本发明涉及的一种来自人体肠道微生物菌株产生的降解壳聚糖的壳聚糖酶，其特征在于酶活力高，热稳定性强，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足的之处，提供一种热稳定性好、酶活高的壳聚糖酶突变体。

一种壳聚糖酶突变体，突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQ ID NO:4所示；

或，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述壳聚糖酶BC345为人肠道菌Bacteroides clarus YIT 12056菌株基因组DNA中壳聚糖酶BC345。

一种壳聚糖酶突变体用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。

一种重组质粒，所述重组为含所述壳聚糖酶的基因的质粒。

所述质粒载体为pPCIZα。

一种含所述重组质粒的基因工程菌株。

所述重组质粒转化至毕赤酵母中获得。

一种所述基因工程菌株壳聚糖酶用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。