[发明专利]一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法

说明书

本发明涉及药物合成领域，公开了一种对干扰素IFN α‑2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法，本方法是利用一种固定化的谷氨酰胺转氨酶对干扰素IFN α‑2b进行定点的聚乙二醇化修饰。谷氨酰胺转氨酶是一种用于催化酰基转移反应的转移酶，这种酶被证明具有高度的定点催化作用，因此在谷氨酰胺转氨酶的介导作用下可以实现干扰素IFN α‑2b的定点聚乙醇化修饰。另一方面，由于使用的是固定化谷氨酰胺转氨酶，其化学和pH稳定性较高，而且在定点修饰过程中操作方便，可重复利用率高，因此可大幅度降低产品的生产成本。

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法。

背景技术

干扰素（Interferon, IFN）是一种在特定的诱导剂作用下，由单核细胞分泌的具有高活性、多生物功能的细胞因子，具有抑制病毒复制、抑制细胞分裂以及免疫调节等功能。在众多干扰素IFN类型当中，IFN α-2b是最早被发现的亚型之一，是一种抗病毒、抗肿瘤药物，并且具有免疫调节活性，其广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能能力最强，在多种疾病治疗中发挥不可替代的作用，例如可以用于治疗病毒性乙型肝炎、丁型肝炎、病毒性脑膜炎、病毒性眼感染、复发性角膜炎、肾癌、毛细白血病、恶性皮肤淋巴瘤、成骨肉瘤、多发性硬化症等疾病。

但是目前对于使用干扰素进行治疗的病人来说，干扰素IFN α-2b具有免疫原性高、体内循环半衰期短和稳定性差的问题，需要经常进行皮下注射使药物的血药浓度维持在有效的范围内，这给病人带来了较大的痛苦和极大的不便。因此制备高纯度的长效化IFNα-2b有着极大的研究和临床意义。目前许多研究者正致力于长效干扰素IFN α-2b的改造，而利用聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）聚合物对其进行共价修饰是克服这些弊端的有效方法之一。蛋白质的聚乙二醇化是通过增加药物分子的流体力学体积，减少肾清除，从而延长蛋白质药物的血浆半衰期。目前进行的PEG化反应，多是针对蛋白质肽链上自由末端胺基进行的，由于蛋白质分子中这样的位点较多，PEG的修饰无选择性，导致修饰产物多样化而带其分离困难，质量不易控制的问题。因此需要使用一种对IFN α-2b进行定点修饰的方法来避免蛋白质药物随机修饰带来的活性下降和二次分离提纯的弊端。

发明内容

为克服上述技术问题，本发明提供了一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种对干扰素IFN α-2b进行定点聚乙二醇长效化修饰的方法，包括以下步骤：

1）使用带有功能性官能团的固体载体对谷氨酰胺转氨酶进行固定，制得固定化的谷氨酰胺转氨酶；所述功能性官能团包括可以与酶大分子上的伯胺基团发生化学反应的羧基、醛基、环氧基、琥珀酰亚胺基中的一种；

2）首先将干扰素IFN α-2b溶于磷酸缓冲液中形成浓度为1.5 mg/mL的蛋白质溶液，在蛋白质溶液中加入带有伯胺基团的聚乙二醇搅拌使其完全溶解，然后加入固定化的谷氨酰胺转氨酶，搅拌反应5 h，然后加入碘乙酰胺使反应停止，得到的反应产物使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液稀释至蛋白质浓度为1.0 mg/mL的溶液，然后使用pH 7.4、浓度10 mM的磷酸缓冲液进行两次透析得到定点聚乙二醇化的干扰素IFN α-2b。