[发明专利]用于检测病毒与人基因HPV58-CMAHP融合突变的引物组合、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了用于检测病毒与人基因HPV58‑CMAHP融合突变的引物组合、试剂盒及其使用方法，属于生物技术及医学领域。本发明提供的用于检测HPV58‑CMAHP融合突变的引物组合，包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。还提供用于检测人肿瘤组织中HPV58‑CMAHP融合突变的试剂盒，其含有前述的引物组合与特异性探针。该试剂盒的使用方法包括以下步骤：（1）提取检测样本中的RNA,所述样本需来自新鲜样本。（2）将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；（3）根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。本发明建立了实时荧光PCR体系，检测速度快，准确性高。

技术领域

本发明涉及生物技术及医学领域，具体地说，涉及用于检测病毒与人基因HPV58-CMAHP融合突变的引物组合、试剂盒及其使用方法。

背景技术

高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是引起宫颈癌(cervicalcancer，CC)发生的重要因素。在女性生殖道中约发现超过40种人乳头瘤病毒，其中15种为与宫颈癌发生相关的高危型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82)。HPV16和HPV18是最常见的与宫颈癌相关的型别，而非HPV16/18型在宫颈细胞内瘤样变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的分布有着显著的地域性差异。有研究显示HPV58型占中国东北地区宫颈癌患者第二位，感染率为7.79％。然而，并非所有高危型HPV感染都会最终进展为恶性病变，一般认为长期持续的HPV感染会导致患者从CIN逐步进展为宫颈癌，同时有研究显示某些特异的型内变异可能会影响HPV的持续感染而最终导致癌前病变转变为癌症。

HPV DNA在良性肿瘤和低度癌前病变中多以游离形式存在，而在恶性病变及高度癌前病变中常以单拷贝或多拷贝整合于宿主细胞基因组中。病毒基因整合入宿主细胞的部位通常发生在E1或E2区。病毒整合时，E2的断裂或缺失导致其开放阅读架失活，对病毒癌基因表达负反馈调节作用缺失，使E6、E7基因过度表达而导致细胞生长失控。目前，有关HPV整合的研究大多数针对HPV16和18型，研究显示HPV在不同宫颈病变中的整合率随HPV感染型别的不同而变化。

目前，还没有准确、高效的方法可以临床上来检测HPV整合到人基因组的检测方法。以往有关HPV整合的检测多采用southern blot或是传统PCR技术，其技术局限性也很大程度上制约了准确结果的发现，无法系统全面的解析宿主基因组中HPV的整合断点。在HPV基因组中含有大量突变，这会导致PCR检测失败。即使使用全基因组检测技术（WGS），HPV病毒整合断点的检测灵敏度也较低，二代测序技术受限于测序读长较短、分析难度大等，很容易出现假阴性结果。

发明内容

为了解决目前还没有一种检测高危型人乳头瘤病毒HPV58整合到人基因CMAHP的HPV58-CMAHP融合突变检测方法，本发明的目的是提供HPV58-CMAHP融合突变的检测引物、探针及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了用于检测HPV58-CMAHP融合突变的引物组合，包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。该引物组合可以特异性识别HPV58-CMAHP融合突变。

不仅如此，本发明还提供了与所述引物组合配合使用的特异性探针，其序列如SEQID NO:3所示，其5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

第二方面，本发明提供了用于检测人肿瘤组织中HPV58-CMAHP融合突变的试剂盒，其含有前述的引物组合与特异性探针。

为了提高所述试剂盒的检测准确度，所述试剂盒还含有质控系统，阳性对照液和空白对照液。