[发明专利]一种不对称扩增靶核酸的方法

说明书

本申请涉及核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，本申请提供了一种同时、不对称扩增样品中的一个或多个靶核酸的方法，所述方法能够同时不对称扩增样品中存在的多种靶核酸，能够同时能产生大量的单链产物。

技术领域

本申请涉及核酸分子的多重、不对称扩增。特别地，本申请提供了一种同时、不对称扩增样品中的一个或多个靶核酸的方法，所述方法能够同时不对称扩增样品中存在的多种靶核酸，能够同时产生大量的单链产物。

背景技术

不对称PCR，由Gyllensten等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988，85:7652-7656)首次描述，是指利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。不对称PCR产生的单链DNA可以用于测序，用作探针，或在实时PCR、基因芯片检测、探针熔解曲线分析中改善检测信号。然而，传统的不对称PCR通常需要精心的优化，以最大限度地产生特定的单链产物和最小化非特异性扩增。当需要同时不对称扩增多个靶核酸序列时，由于引物对的增加，导致引物二聚体等非特异性扩增的增加，更增加了设计和优化的难度。

在传统的不对称PCR扩增中，由于限制性引物浓度降低，导致其熔点低于PCR反应的退火温度，这进而导致了不对称PCR扩增的低效性。针对此，Sanchez等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，101:1933-1938)提出LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential-PCR),其中，在引物设计时增加了引物的实际使用浓度作为影响引物熔点(T_m)值的因素，以期提高低浓度限制性引物的T_m值，使其高于退火温度，从而提高不对称PCR的扩增效率，以产生大量的单链产物。该方法解决了不对称PCR扩增效率低的问题，使不对称PCR更易于优化。然而，该方法未能解决引物对增加导致的非特异性扩增增加的问题，仍然很难实现多重不对称PCR扩增。

Brownie等人(Nucleic Acids Research 1997,26:3235-3241)描述了一种同源标签辅助的无引物二聚体系统(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，HAND系统)。在该系统中，在靶特异的上游引物和下游引物的5'端均加上同样的标签序列，形成加尾/加标签的靶特异性引物。在PCR扩增时，首先由低浓度的加尾/加标签的特异性引物在较低的退火温度下启动初始PCR扩增；几个循环之后，在升高的退火温度下，由一条高浓度的通用引物对初始PCR扩增的扩增产物进行后续扩增。由于特异性引物均含有同样的标签序列，由初始PCR扩增产生的所有产物(包括引物二聚体)的末端都具有互补的标签序列。引物二聚体等小片段产物的单链由于局部浓度较高容易自身退火形成稳定的“锅柄(pan-handle)”结构，阻止通用引物进一步的退火，从而抑制引物二聚体的扩增。通过结合采用低浓度的加同源标签的靶特异性引物和高浓度的通用引物，HAND系统能够有效抑制引物二聚体的扩增，实现多重PCR的有效扩增，并保持较高的扩增效率和检测灵敏度。然而，使用HAND系统的PCR扩增是对称扩增，无法产生单链产物，这导致HAND系统在基因芯片、探针熔解曲线分析等技术领域的应用受到了限制。

因此，需要开发新的能够同时不对称扩增多个靶核酸的方法，其能够同时实现有效的多重PCR扩增和不对称PCR扩增，满足临床上对多个靶核酸同时进行扩增和检测的要求。

发明内容

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”是指待检测的目标核酸或其序列。在本申请中，术语“靶核酸序列”、“靶核酸”和“靶序列”具有相同的含义，并且可互换使用。