[发明专利]一种梅毒螺旋体检测引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种梅毒螺旋体检测引物及试剂盒，利用梅毒螺旋体polA基因在不同梅毒螺旋体亚种间高度保守的特点，通过优化设计polA基因位点的引物、探针，保证了梅毒螺旋体检测的特异性，将其结合数字PCR技术对梅毒螺旋体进行检测，大大提升了检测的灵敏度和时效性，为治疗疗效监测、治疗预后判断提供了有力帮助。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种梅毒螺旋体检测引物及试剂盒。

背景技术

梅毒是由螺旋体科、密螺旋体属的梅毒螺旋体感染导致的性传播疾病，该病原体因在镜下颜色透明且不易被染料着色，故又称苍白螺旋体。梅毒最早发现于北美，于16世纪传入中国，一度在解放前成为中国四大性病之首，又在20世纪中叶基本消灭。但自从20世纪80年代开始，梅毒在中国境内重新出现，全国梅毒病例报告数量又一次明显加且流行性逐年快速上升。从1999年新发病例80506例发展到2009年新发病例327433例，发病率每年以平均14.3％的速度增长。根据中国疾病预防控制局发布的数据显示，2018年全国新发梅毒病例494867例，发病率仅次于病毒性肝炎、肺结核，在全国甲乙类传染病中发病率位列第三。

梅毒根据传染途径可分为先天性梅毒与后天性梅毒，其中后天性梅毒主要经由性接触、输血、创口等途径侵入人体，在经过2-4周潜伏期后，梅毒螺旋体在感染处大量繁殖，引起机体免疫反应形成局部硬下疳，并经由淋巴、血液播散全身，可引起神经、心血管等多系统损害，严重时甚至威胁生命。而先天性梅毒主要经由母婴途径突破胎盘屏障进行垂直传播，导致自发性流产、死产或先天梅毒等。根据世界卫生组织的统计数据显示，2016年有98.8万名孕妇感染梅毒，导致逾35万例不良分娩结果，其中有20万例死产或新生儿死亡。

梅毒根据病程分为潜伏期、I期梅毒、II期梅毒、III期梅毒，其中潜伏期是梅毒治疗的黄金时期，此时病原体主要在感染处局部繁殖，尚未播散全身，如及时使用青霉素等抗生素，可以极大提高梅毒治愈率，并有效控制病原体进一步播散。但是潜伏期梅毒产生的症状、体征各不相同，往往没有特异性的表现，感染者常因为没有及时治疗而进一步发展为I期梅毒、II期梅毒乃至III期梅毒。因此有效的早期梅毒检测方法对于梅毒监控、防治至关重要。

当前临床常用的梅毒检测方法主要有暗视野显微镜检查法、非梅毒螺旋体抗原血清学试验(RPR)、梅毒螺旋体抗原血清学试验以及荧光定量PCR方法。

暗视野显微镜法可以在梅毒感染早期通过形态学方法观察到创口处采集到的活体梅毒螺旋体，从而及早发现梅毒感染。但是该方法需要依靠主观判断鉴别创口处其它病原体，对于检测人员技术水平要求较高。并且由于早期梅毒病原体数量较少，在镜下常常难以观察到，因此该方法的灵敏度较低，经常发生漏检。

非梅毒螺旋体抗原血清学试验(RPR)是利用牛心肌脂抗原，检测患者血浆中在梅毒感染后产生的非特异性抗心磷脂抗体的梅毒初筛试验。该方法具有操作简单、快速，对于检测人员技术水平要求较低等优点。但是该方法易与其它病毒感染产生的抗体发生交叉反应，造成假阳性现象。并且在感染早期，患者血清中非特异性抗心磷脂抗体产生的数量较少，因此该方法并不适用于早期梅毒检测诊断。

梅毒螺旋体抗原血清学试验是利用抗原抗体结合原理，使用梅毒螺旋体抗原特异性检测患者血清中抗梅毒螺旋体抗体。该方法克服了非梅毒螺旋体抗原血清学试验(RPR)特异性较差的缺点，可以作为梅毒螺旋体的确证试验。但是该方法检测的特异性抗梅毒螺旋体主要有IgM、IgG抗体，IgM抗体持续时间短，IgG却持续时间长，甚至可终生存在，导致血清学检测持续阳性，难以监测治疗效果。同时该方法与非梅毒螺旋体抗原血清学试验一样具有检测窗口期的局限性，并不适用于早期梅毒检测诊断。

荧光PCR检测梅毒螺旋体灵敏度高，无需等待梅毒螺旋体繁殖和机体免疫应答反应，具有检出时间早的优点。此外通过荧光定量PCR可以检测患者体内病原体拷贝数情况，有助于判断疾病进展阶段、监测治疗效果。但是由于荧光定量PCR检测原理的限制，该检测方法的检出限仍然难以达到单个拷贝，对于患病早期的检测效果仍有欠缺。