[发明专利]一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用，涉及生物工程技术领域，利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组技术，构建假单胞菌的gndL(gndC或gndS)和2kgdH的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2‑酮基葡萄糖酸的转化，然后利用该菌株转化葡萄糖为葡萄糖酸。在本发明实施例中，将变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的种子培养液接种于发酵培养基中，发酵20h后，变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的发酵液中积累的葡萄糖酸为60.04g/L。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用。

背景技术

葡萄糖酸是葡萄糖的醛基经氧化生成的一种有机酸，广泛应用于食品、饮料、化工、制药、纺织、洗涤剂、皮革、建筑等行业。

文献报道的葡萄糖酸生产方法主要有均相化学氧化法、多相催化氧化法、电解氧化法、酶催化氧化法和生物发酵法等。其中，发酵法是目前最为经济、高效和环境友好的葡萄糖酸的生产方法，在国内外工业生产中得到了普遍采用。

在葡萄糖酸的发酵生产中，通常采用的菌种为丝状真菌黑曲霉(Aspergillusniger)，即利用其葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖为葡萄糖酸内酯，然后水解生成葡萄糖酸。

相对于黑曲霉而言，假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌具有更好地适应不同理化环境和营养环境、耐受内源性和外源性胁迫的性能。同时，假单胞菌具有高效的葡萄糖胞外氧化系统，在适宜的培养条件下，能够快速、经济地将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并进而氧化为2-酮基葡萄糖酸。因此，如能利用代谢工程手段阻断葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，将有可能把假单胞菌改造成为高产葡萄糖酸的工程菌株。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用，构建假单胞菌的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，可将该菌株应用于葡萄糖向葡萄糖酸的转化生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组变形假单胞菌，以变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；

所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因包括gndL、gndC或gndS，所述gndL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述gndC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述gndS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了所述重组变形假单胞菌的构建方法，包括以下步骤：分别利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组的方法敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，再敲除所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH。

优选的，在敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因时所利用的引物，包括L1、L2、L3和L4；所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，L2的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，L4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选的，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndL进行验证。

优选的，所述验证为以所述重组菌株JSU01ΔgndL的基因组DNA为模板，以L1和L4为引物进行PCR验证。