[发明专利]一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组变形假单胞菌，其特征在于，以变形假单胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；

所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因为gndL，所述gndL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述变形假单胞菌JSU01的保藏编号为CGMCC No.7150。

2.权利要求1所述重组变形假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：依次利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组的方法敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，再敲除所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，在敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因时所利用的引物，包括L1、L2、L3和L4；所述L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，L4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求2或3所述构建方法，其特征在于，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndL进行验证。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述验证为以所述重组菌株JSU01ΔgndL的基因组DNA为模板，以L1和L4为引物进行PCR验证。

6.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，在敲除所述基础菌株中的所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH时所利用的引物，包括H1、H2、H3和H4；所述H1的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

7.根据权利要求2或6所述构建方法，其特征在于，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndLΔ2kgdH进行验证。

8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述验证为以所述重组菌株JSU01ΔgndLΔ2kgdH的基因组DNA为模板，以H1和H4为引物进行PCR验证。

9.权利要求1所述重组变形假单胞菌在发酵生产葡萄糖酸中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，在发酵生产葡萄糖酸时，所利用的发酵培养基包括：140.0 g/L淀粉水解糖、1.0 g/L尿素和40.0 g/L轻质CaCO₃；所述发酵生产的条件，包括：搅拌转速为430 r/min、温度为33℃、罐压为0.02 MPa和通气量为42.0 L/min。