[发明专利]缓冲液及其应用

说明书

本发明公开了缓冲液及其应用，其中，该缓冲液包括：33‑66mM Tris缓冲液，1.6‑5mM二价阳离子、25‑75mM一价阳离子、0.5‑10mM二硫苏糖醇(DTT)、5‑15％PEG4000‑8000和0.5‑2mM ATP，pH值为7‑9。该缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及缓冲液及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液、一种试剂盒、该缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，以及一种构建核酸文库的方法。

背景技术

构建二代测序文库的一般流程包括：(1)对目的DNA片段化；(2)对游离DNA进行末端平齐化处理；(3)在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；(2)将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。文库构建的目的即为在双链DNA片段两段加上接头。而文库转化率为测得产量与理论最高产量质检的比值，即有多少起始样本被最终转化为两段接有接头的片段。

转化率很大程度上受连接效率的影响，连接反应效率与酶反应效率、DNA链末端开放性、供体和受体的碰撞效率等多个因素相关，同时在连接反应体系中的接头还会产生自连消耗反应中的有效接头数量，是文库构建过程中的一个效率瓶颈。目前市场上通用的快速连接缓冲液其连接反应平台期高度有限，存在增大酶投入量以克服缓冲体系不匹配等情况，提高了实际应用的成本；另外在现有的连接缓冲液下连接时间无法向前推动酶反应平衡；且在预混过程中会产生大量错配降低了文库产量，限制了高通量工作流程的搭建。

由此，现有的连接缓冲液有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种缓冲液，该缓冲液有利于提高连接反应效率，降低错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种缓冲液。根据本发明的实施例，该缓冲液包括：33-66mM Tris缓冲液，2-15mM二价阳离子、25-75mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。

本发明实施例的缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

另外，根据本发明上述实施例的缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，为Tris-醋酸缓冲液。

根据本发明的实施例，所述Tris-醋酸缓冲液的浓度为33-40mM。

根据本发明的实施例，所述二价阳离子为Mg²⁺或Mn²⁺，优选地，为Mg²⁺。

根据本发明的实施例，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-5mM。

根据本发明的实施例，所述PEG4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％。

根据本发明的实施例，所述PEG4000-8000为PEG4000和/或PEG6000。

根据本发明的实施例，所述pH值为8。

根据本发明的实施例，所述缓冲液包括：33-66mM Tris-醋酸缓冲液，5-10mM Mg²⁺、45-55mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG6000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。