[发明专利]一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用

说明书

本发明公开一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：甲基化识别抗体筛选；S2：第n级亲和素配置；S3：中间介质；S4：信号检测介质；S5：荧光编码磁珠选用；S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述捕获基因与待检基因互补配对；S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，形成荧光编码磁珠‑捕获探针‑目标核酸的第一偶联物；S8：分离所述第一偶联物，形成荧光编码磁珠‑捕获探针‑目标核酸‑检测复合物的第二偶联物；S9：洗涤第二偶联物用于检测信号值，确定样本中是否存在目标核酸或其数量，本发明可同时检测多种基因的甲基化状态，特异性高，操作简单，结果时间短，结果简单。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体地说，它涉及一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用。

背景技术

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和沉默，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化、RNA甲基化和组蛋白甲基化，甲基化修饰类型又包括m6A、m5C、m1A等。

DNA甲基化能沉默某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。RNA甲基化调控作用同样受到广泛的重视，通过多种RNA甲基化修饰状态的定量测定也发现RNA甲基化对各种疾病的病发有影响，不同位点的甲基化水平以及多位点的甲基化水平波动会最终与患病存在一定的关系。

目前，在胰腺癌治疗领域，大部分晚期治疗都无法像其他癌症一样取得预期疗效，作为一种侵袭性极高的恶性肿瘤，胰腺癌的早期发现率仅为5％-7％，后期化疗耐药性显著，5年生存率只有5％，依据现有的治疗手段，虽然前期发现并不能让患者完全康复，但是能够极大的延长患者的存活时间，通过保守治疗能够将当前的总体存活时间从6个月延长至2-3年，同时也为后续医疗人员攻克这一医学难题做好时间上的准备。

早期进行检测，遗传异常以及基因表观遗传学的改变具有重要的作用。同遗传学异常一样，表观遗传的改变也是一种可反映肿瘤发生早期的分子机制。DNA甲基化作为表观遗传学的一种重要调控方式，在控制基因的表达、维持基因组稳定性、细胞分化和胚胎发育中起着重要的作用；RNA甲基化则主要包括后转录过程对真核基因表达的调控。因此，检测肿瘤细胞中这2种甲基化的异常成为早期诊断肿瘤的重要手段。但是目前诊断领域仍然缺少对特定疾病通过甲基化状态来预判身体状态的方案，目前所有的相关资料均只是提及某些基因位点甲基化会对肿瘤病发有影响，缺乏实际应用的实例。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，其相对于常规的基因甲基化检测本发明可同时检测多种基因的甲基化状态，特异性高，操作简单，可较短时间出结果，结果简单明了，不需要大量专业知识。此外，本发明还可以根据偶联的抗体不同，可检测多种类型的甲基化位点的优点。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种甲基化基因免PCR扩增分析方法：

S1：甲基化识别抗体筛选；

S2：第n级亲和素，其中n为5-10的正整数；

S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链或标记有生物素的小分子量蛋白质；所述的中间介质一端与第n级亲和素结合，而另一端与第n+1级亲和素结合，其中n为5-10的正整数；

S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，而且信号检测介质中的亲和素与第n级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；

S5：荧光编码磁珠选用；