[发明专利]一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用

权利要求书

1.一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，

S1：甲基化识别抗体筛选；

S2：第n级亲和素，其中n为5-10的正整数；

S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链或标记有生物素的小分子量蛋白质；所述的中间介质一端与第n级亲和素结合，而另一端与第n+1级亲和素结合，其中n为5-10的正整数；

S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，而且信号检测介质中的亲和素与第n级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；

S5：荧光编码磁珠选用；

S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；

S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；

S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；

S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。

2.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，所述的荧光编码磁珠为两种颜色按不同比例混合形成的带有不同荧光编码的磁珠。

3.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：

步骤1：将含有甲基化位点的双链寡核苷酸与固定于固相载体上的根序列接触并结合；

步骤2：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述双链寡核苷酸接触并结合，从而形成稳定的捕获序列-抗体的复合物，随后去除过量的抗体；

步骤3：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；

步骤4：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；

步骤5：重复步骤3-4共n-1次，从而获得第n级生物素-亲和素的复合物；

步骤6：将标记有亲和素的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；

步骤7：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。

4.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，所述中间介质为10-100bp单链核苷酸。

5.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，中间介质为分子量30-60KD的蛋白质。

6.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，荧光蛋白包括PE、AFP或者其组合。

7.一种如权利要求1-6任意一项甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用。

8.根据权利要求7所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，应用于恶性肿瘤早期检测领域。

9.根据权利要求8所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，恶性肿瘤为胰腺癌。

10.根据权利要求9所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，甲基化识别抗体具体对应：let-7a-5p（m6A）、miR-17-5p（m6A）、lncRNA KCNK15-AS1（m6A）、CDID（m5C）、SPARC（m5C）。