[发明专利]一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提出了一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒，包括用于检测微卫星不稳定状态的引物组，所述引物组针对NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123、Penta D和TPOX这10个微卫星位点设计上下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑20所示，特异性强，覆盖范围广。本发明还提出了一种微卫星不稳定状态的检测方法，该检测方法基于多重荧光PCR技术和毛细管电泳技术，利用本发明试剂盒检测多个微卫星位点的不稳定状态，操作方便快捷，特异性和灵敏度高，重现性好，结果精准可靠。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

微卫星序列指核心序列为1至6个碱基的短串联重复结构，这些序列广泛分布在整个人类基因组中。当DNA错配修复功能受损时，可导致微卫星重复序列长度改变，这种现象称为微卫星不稳定(Micro-Satellite Instability，MSI)。MSI是DNA修复缺陷型肿瘤细胞的特征之一，约15％的结直肠癌存在MSI。MSI检测被美国国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南及中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(CSCO)结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结直肠癌患者，被NCCN胃癌临床实践指南推荐用于局部晚期、复发或转移的考虑用PD-1抑制剂治疗的胃癌患者。MSI检测可用于癌症患者肿瘤组织的MSI状态分析，为结直肠癌患者的诊断和预测免疫治疗疗效、初筛Lynch综合征患者、评估II期结直肠癌预后、预测II期结直肠癌辅助化疗疗效提供参考。

1998年，美国国家癌症研究所(NCI)推荐了用于结直肠癌MSI，即为Bethesdapanel。2001年，研究者提出用BAT26单个位点分析结直肠MSI状态，其分析结果与Bethesdapanel高度一致。该研究表明Bethesda panel时，仅存在双核苷酸MS位点“不稳定”时，不能立即判定为MSI-H，需分析额外的单核苷酸重复MS位点，以排除MSI-L，由此可知，要区分MSI-L与MSS需要更多的位点。

2002年，基于双核苷酸重复MS位点的低灵敏性，单核苷酸重复MS位点的低特异性：单核苷酸重复MS位点的几近单态性，因此，NCI提出5个单核苷酸重复MS位点(BAT26、BAT25、NR21、NR22、NR24)用于MSI分析，判读标准为：≥3个位点检出不稳定判定为MSI-H。但是，如果激光系统不能完美校准，NR22在不同位点之间会产生干扰。2004年，修正后的Pentaplexpanel包括BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR27。2014年，NCI建议Bethesda panel或Pentaplexpanel联合HT-17用于MSI状态分析，尤其针对大量正常DNA污染的样本。由此可知，NCI给出的判断标准可以联合使用。

目前主要以PCR技术为基础研究微卫星不稳定性改变，较常用的是对选定的6个单碱基重复位点不稳定情况进行检测，无法检测所选定基因的其他多态性位点，检测不全面，判定结果并不可靠。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种微卫星不稳定状态的检测试剂盒及其检测方法，对10个微卫星位点(其中包括两个内参)进行了MSI状态分析，具体为5个单核苷酸重复位点和3个双核苷酸重复位点以及2个对照位点(四核苷酸重复位点和五核苷酸重复位点)，覆盖面积更广，提高了检测的准确性，不仅可以检测单碱基重复位点而且可以检测多核苷酸重复位点。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于检测微卫星不稳定状态的引物组，包括针对微卫星位点NR21、D5S346、NR24、BAT25、D17S250、MONO27、BAT26、D2S123和Penta D设计的上下游引物，具体如下：

NR21上游引物NR21-F1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，