[发明专利]一种用于免疫分析的高效氯氟氰菊酯半抗原、活化载体蛋白、完全抗原及多克隆抗体

说明书

本发明涉及检测技术领域，公开了一种用于免疫分析的高效氯氟氰菊酯半抗原、活化载体蛋白、完全抗原及多克隆抗体。本发明低毒性试剂选择性水解氰基，可一步法制备高效氯氟氰菊酯半抗原，将高效氯氟氰菊酯中的氰基转化为酰胺。将该带酰胺基的半抗原与琥珀酸酐活化的载体蛋白偶联成完全抗原，并用制备相应的多克隆抗体。该抗体对高效氯氟氰菊酯的最低检出限为10μg/L，对其他拟除虫菊酯类农药(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊酸酯)无明显交叉反应。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种用于免疫分析的高效氯氟氰菊酯半抗原、活化载体蛋白、完全抗原及多克隆抗体。

背景技术

拟除虫菊酯类杀虫剂是一类模拟天然除虫菊酯的合成杀虫剂，是一种由菊酯生物合成的昆虫神经毒素。到目前为止，拟除虫菊酯已经占据了全球农药市场18％以上的份额。高效氯氟氰菊酯(如下文式1所示)是该类杀虫剂的重要组成之一，在农业生产中有着广泛的应用。尽管人们普遍认为它的毒性很低，但最近的两项研究结果对这种分子对人体的安全性提出了重大质疑。例如，研究表明，过度暴露于氰菊酯可能导致肌痛性、急性呼吸道刺激性损伤和休克。另一方面，由于在蔬菜、水果和鱼类等食品中发现高效氯氟氰菊酯残留，使人接触到氰菊酯的风险大大增加。为了控制人类对该杀虫剂的接触，许多国家和地区都对高效氯氟氰菊酯残留有严格的规定。例如，中国和欧盟食品中高效氯氟氰菊酯的最大残留限量分别为0.05mg/kg～15mg/kg和0.02mg/kg～1mg/kg。

目前，食品中菊酯类化合物(包括高效氯氟氰菊酯)的残留分析主要采用高效液相色谱法(HPLC)或GC-MS法。尽管这些仪器分析方法具有较高的准确度和较低的检出限(LOD)，但由于成本高(尤其是在较贫穷的国家)、样品制备复杂、与现场检测不兼容(如农市场)等原因，这些方法的广泛应用受到了影响。与仪器方法相比，免疫分析法更便宜、更简便，尤其适合现场检测，因此受到了学术界和工业界的广泛关注。免疫检测方法的发展一般遵循半抗原合成、半抗原蛋白偶联和抗体形成三个步骤，其中半抗原合成通常被认为是关键步骤。在高效氯氟氰菊酯的半抗原合成中，虽然已经发表了多种合成方法，但是它们的合成路线仍然有优化的空间(如下文所示)。例如，Gao等报道了拟除虫菊酯半抗原的多步合成，但该方法存在高毒性试剂(其他一些拟除虫菊酯半抗原合成方法也存在此问题，例如c中Lee等报道的方法)，总收率低(10.4％)的问题。Luo和其同事报道了使用无毒KMnO₄氧化一步合成高效氯氟氰菊酯半抗原的方法，但是这种方法去掉了区分不同拟除虫菊酯的关键官能基(-CF₃和-Cl)，得到的半抗原的结构过于普遍，因此被认为是非特异性的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明利用低毒性试剂选择性水解氰基，可一步合成高效氯氟氰菊酯半抗原。将该带酰胺基的半抗原与琥珀酸酐活性载体蛋白结合形成完全抗原，后者用于生成多克隆抗体。该抗体对高效氯氟氰菊酯的最低检出限为10μg/L，对其他拟除虫菊酯类农药(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊酸酯)无明显交叉反应。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于免疫分析的高效氯氟氰菊酯半抗原，其分子结构式为：

第一方面，本发明提供了一种高效氯氟氰菊酯半抗原的一步合成方法，其化学反应过程如下所示：

在半抗原的合成方面：本发明为了构建具有高特异性的高效氯氟氰菊酯抗原，第一个要求是设计一个简单和安全的半抗原。本发明直接从高效氯氟氰菊酯进行修改(它包含所有的结构信息，而且相当便宜)以达到最高效。并且坚持只使用非有毒试剂或低毒试剂。此外，我们更倾向于对杀虫剂结构进行最小的修改，以确保最终抗原的识别和特异性。