[发明专利]酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。该酵母双杂交载体包括：pNC‑GADT7载体和pNC‑GBKT7载体；所述pNC‑GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；所述pNC‑GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框。该Nimble Cloning的酵母双杂交载体，以方便目标基因克隆到载体。具有操作简单、克隆效率高、可标准化克隆等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。

背景技术

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。目前使用的酵母双杂交载体主要是基于酶切-连接和Gateway这两种克隆技术，存在操作繁琐或试剂昂贵等问题。

因此，提供一种操作简单、克隆效率高、可标准化克隆的酵母双杂交载体具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用。本发明构建了一套基于Nimble Cloning的酵母双杂交载体。使用该套载体，可利用NimbleCloning克隆技术将目标基因克隆到载体上，进而用于蛋白互作研究。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了酵母双杂交载体，包括：pNC-GADT7载体和pNC-GBKT7载体；

所述pNC-GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；

所述pNC-GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；

所述Nimble Cloning克隆框由如SEQ ID No.1所示的第一接头序列、SfiI酶切位点、ccdB基因、SfiI酶切位点和如SEQ ID No.2所示的第二接头序列依次连接组成。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的酵母双杂交载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：根据酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的克隆位点处的序列，分别扩增获得插入到pGADT7的Nimble Cloning克隆框AD-NC和插入到pGBKT7的Nimble Cloning克隆框BD-NC；

步骤2：取pGADT7经NdeI和XhoI双酶切，回收的线性化载体pGADT7与AD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GADT7；

步骤3：取pGBKT7经NdeI和PstI双酶切，回收的线性化载体pGBKT7与BD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GBKT7。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中扩增获得插入到pGADT7的NimbleCloning克隆框AD-NC的引物组包括如SEQ ID No.3所示的正向引物NC-ADF以及如SEQ IDNo.4所示的逆向引物NC-ADR；