[发明专利]酵母双杂交载体、构建方法及其在蛋白互作中的应用

权利要求书

1.酵母双杂交载体，其特征在于，包括：pNC-GADT7载体和pNC-GBKT7载体；

所述pNC-GADT7载体于pGADT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；

所述pNC-GBKT7载体于pGBKT7载体的克隆位点处插入Nimble Cloning克隆框；

所述Nimble Cloning克隆框由如SEQ ID No.1所示的第一接头序列、SfiI酶切位点、ccdB基因、SfiI酶切位点和如SEQ ID No.2所示的第二接头序列依次连接组成。

2.如权利要求1所述的酵母双杂交载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：根据酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7的克隆位点处的序列，分别扩增获得插入到pGADT7的Nimble Cloning克隆框AD-NC和插入到pGBKT7的Nimble Cloning克隆框BD-NC；

步骤2：取pGADT7经NdeI和XhoI双酶切，回收的线性化载体pGADT7与AD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GADT7；

步骤3：取pGBKT7经NdeI和PstI双酶切，回收的线性化载体pGBKT7与BD-NC混合，反应产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，获得含NC克隆框的酵母双杂交载体pNC-GBKT7。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1中扩增获得插入到pGADT7的Nimble Cloning克隆框AD-NC的引物组包括如SEQ ID No.3所示的正向引物NC-ADF以及如SEQ ID No.4所示的逆向引物NC-ADR；

步骤1中扩增获得插入到pGBKT7的Nimble Cloning克隆框BD-NC的引物组包括如SEQID No.5所示的正向引物NC-BDF以及如SEQ ID No.6所示逆向引物NC-BDR。

4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1中所述扩增的条件为：94℃2分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；最后72℃延伸5分钟。

5.如权利要求1所述的酵母双杂交载体或如权利要求2至4任一项所述构建方法获得的酵母双杂交载体在蛋白互作研究中的应用。

6.不同蛋白互作的鉴定方法，其特征在于，以如权利要求1所述的酵母双杂交载体或如权利要求2至4任一项所述构建方法获得的酵母双杂交载体作为克隆载体，步骤包括：

步骤1、分别扩增获得所述不同蛋白的基因；

步骤2、分别将所述不同蛋白的基因、所述克隆载体和Nimble Mix混合后反应，反应产物转化感受态细胞，挑选单克隆进行PCR和测序鉴定，分别获得含有不同蛋白基因的重组质粒；

步骤3、转化酵母感受态细胞并使用选择培养基培养，若转化菌株均能生长，表明所述不同蛋白之间发生互作，否则，所述不同蛋白不能发生互作。

7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2中的反应为50℃反应1h；

所述Nimble Mix包含SfiI限制性内切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶；

步骤2中所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；

步骤3中所述感受态细胞为酵母AH109感受态细胞。