[发明专利]HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用

说明书

本发明提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，包括如下步骤：（1）通过分离大鼠坐骨神经损伤后不同时间点的背根神经节神经元核蛋白，进行转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；（2）应用PCR技术，观察HOXD9的相关信使RNA结果表达量及表达趋势；（3）采用免疫荧光染色方法，在DRG神经元中显示HOXD9的胞内定位；（4）统计坐骨神经损伤后不同时间点的HOXD9荧光强度变化趋势，在3天时荧光强度达到最亮，与PCR实验获得的结果趋势一致。本发明明确了HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。

技术领域

本发明属于神经科学基础医学领域，具体涉及一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用。

背景技术

HOX（homebox，同源盒基因）基因家族包括四个基因簇：HOXA，HOXB，HOXC，HOXD。其中，HOXD9基因在脊椎和上肢发育过程中起到了重要作用，在如肾脏、睾丸、结肠、脾脏、胎盘和膀胱等组织中均存在高表达。HOXD9在肝细胞癌研究中表现为原癌基因的作用，对于癌细胞的迁移和入侵具有促进作用。HOXD9表达下调则会导致在多种癌症中的DNA启动子高度甲基化从而影响肿瘤预后。然而，HOXD9在神经损伤及修复中的作用及机制尚不明确。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用，明确HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，包括如下步骤：

（1）通过取不同时间点坐骨神经夹伤的SD大鼠L4-6背根神经节，置于无Ca₂+/Mg₂+-Hibernate A中，剪去多余组织后转入1mg/mL胶原酶中，37℃消化90min，再用0.25%胰酶37℃消化15min，加入终止液终止反应，用1mL枪头吹打，充分混匀，离心，900rpm×5min；弃上清，15%BSA离心2次，900rpm×5min；弃上清，加入培养基，混匀细胞，过200目筛网，最后得到较纯的DRG神经元；将细胞快速冻存，待所有时间点收齐后，进行核蛋白分离和转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；

（2）应用PCR技术，观察HOXD9的相关信使RNA结果表达量及表达趋势；

（3）采用免疫荧光染色方法，在DRG神经元中显示HOXD9的胞内定位；

（4）统计坐骨神经损伤后不同时间点的荧光强度变化趋势，3天时荧光强度达到最亮，与PCR实验获得的结果趋势一致。

其中，步骤（1）中的时间点包括0h、15min、30min、3h、12h、1d和3d。

其中，步骤（1）中所用终止液为含10% FBS的PBS溶液。

其中，步骤（1）中SD大鼠的重量为180～220g。

本发明还提供一种HOXD9基因的应用，用于制备促神经再生药物。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

本发明明确了HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。

附图说明

图1为本发明中坐骨神经夹伤后不同时间点HOXD9表达量变化图；

图2为本发明中HOXD9 Cas9-CKO小鼠纯合子注射病毒后坐骨神经夹伤透明化染色结果图。

具体实施方式