[发明专利]基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用

说明书

基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用，以核酸为靶标，在酶的辅助下反应并有多种途径形成能产生比色信号的G‑四链体序列，进行可视化检测核酸的方法。该方法控制反应条件，在T4 DNA连接酶的作用下被目标基因打开的发夹探针(HGP)与另一条双链DNA(DGP)连接在一起，完成重塑。然后在DNA聚合酶和限制性内切酶的协同作用下，目标DNA实现了循环利用，并且产生了多个生成G‑四链体序列的渠道。本发明以酶辅助DNA反应，形成大量的G‑四链体，通过紫外分光光度计进行检测，也可以用肉眼进行可视化检测。检测方法便捷，所用材料均已商品化，生物安全性高。

技术领域

本发明属于核酸可视化检测领域，特别是指基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用。

背景技术

核酸的高灵敏检测在生物医药应用领域极具潜力。DNA和RNA包含了疾病病理学特征和发展过程中重要的信息，可以作为研究癌症发病机制、识别感染及其耐药性的重要生物标志物。急性淋巴细胞白血病（ALL）作为最常见的人类恶性肿瘤疾病之一，在儿童中的患病率最高。Pax-5是在造血系统中发现的唯一paired-box（PAX）家族成员，它可以分为Pax-5a，Pax-5b，Pax-5c，Pax-5d和Pax-5e。其中，Pax-5a是最重要的，Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5对于B细胞分化和发育非常重要，其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而，目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。因此，开发一些简便有效的Pax-5基因检测方法是非常迫切且极具生命学意义的。

然而由于核酸含量在生物体中非常低，对信号进行扩增放大的方法因此被广泛应用，如PCR扩增或者实时PCR扩增。PCR扩增尽管有明显的优势，但昂贵的设备和专业技术人员的要求限制了该方法的广泛使用。因此更加简便的扩增方法成为研究的热点。最近一些研究报道了G-四链体作为信号源的检测手段都展现了良好的检测性能，G-四链体是由四个鸟嘌呤（G）碱基首尾相连通过π-π堆积进一步形成的特殊类型的DNA二级结构，当与小分子（如氯化血红素，硫黄素T（ThT）和N-甲基中卟啉IX（NMM））结合使用时，G-四链体可以用作构建一系列基于G-四链体的有效信号转导子，并且不需要额外的对核酸进行修饰。因此，这种基于G-四链体构建的生物传感器对核酸序列进行定量分析极具应用潜力。

发明内容

本发明提出基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用，解决了高灵敏检测Pax-5的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器，包括发夹探针HGP和双链DNA序列DGP，其中发夹探针HGP包括靶DNA配对区域、G-四链体序列区域和被目标基因打开后自身的杂交结合区域；双链DNA序列DGP包括LCP和LGP两条单链DNA，LGP为一段G-四链体序列；LCP包括与目标基因结合的区域、被核酸内切酶识别的序列区域，以及与LCP杂交结合的序列区域。

所述发夹探针HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修饰一个磷酸基团；LCP序列如SEQ ID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。

所述的无标记比色传感器在制备高灵敏检测Pax-5基因的试剂盒或检测仪中的应用。

利用所述的无标记比色传感器检测Pax-5基因的方法，包括以下步骤：

（1）将单链DNA LCP和单链DNA LGP按1:1的体积比混合，37 ℃孵育，得双链的DGP溶液，于4℃保存备用；

（2）将发夹探针HGP与不同浓度Pax-5的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育2 h，再加入步骤（1）中的DGP溶液和T4 DNA连接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性内切酶，使反应管内体系的体积为20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80℃加热20 min使酶失活；