[发明专利]基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用

权利要求书

1.基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器，其特征在于：包括发夹探针HGP和双链DNA序列DGP，其中发夹探针HGP包括靶DNA配对区域、G-四链体序列区域和被目标基因打开后自身的杂交结合区域；双链DNA序列DGP包括LCP和LGP两条单链DNA，LGP为一段G-四链体序列；LCP包括与目标基因结合的区域、被核酸内切酶识别的序列区域，以及与LCP杂交结合的序列区域；

所述发夹探针HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修饰一个磷酸基团；LCP序列如SEQID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的无标记比色传感器在制备高灵敏检测Pax-5基因的试剂盒或检测仪中的应用。

3.利用权利要求1所述的无标记比色传感器检测Pax-5基因的非疾病诊断为目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将单链DNA LCP和单链DNA LGP按1:1的体积比混合，37 ℃孵育2 h，得双链的DGP溶液，于4℃保存备用；

（2）将发夹探针HGP与不同浓度Pax-5的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育2 h，再加入步骤（1）中的DGP溶液和T4 DNA连接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性内切酶，使反应管内体系的体积为20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80 ℃加热20min使酶失活；

（3）将经步骤（2）处理的反应体系冷却到室温，加入HEPES缓冲液和氯化血红素溶液，37℃孵育40分钟；

（4）向经步骤（3）处理的反应体系中加入双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10 min后，采用紫外可见分光光度计检测吸收峰的变化；

（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5的标准溶液浓度，绘制标准曲线；

（6）用待测样本溶液代替不同浓度Pax-5的标准溶液重复步骤（1）-（5），将测得的电信号变化值代入标准曲线得到待测样本中Pax-5的浓度。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中单链DNA LCP和单链DNALGP的物质的量浓度为10 μM。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中发夹探针HGP的物质的量浓度为10 μM，体积为1 μL；不同浓度Pax-5的标准溶液的浓度分别为300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM、0.1 nM、50 pM、25 pM、10 pM、5 pM、0 pM；缓冲液体系为1 μL 的CutSmart缓冲液和1 μL 的NEB buffer 2。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中DGP溶液的体积为2 μL，T4DNA连接酶的浓度为1 U/mL，体积为2 μL；DNA聚合酶为0.5 μL浓度为5 U/μL的KlenowFragment；dNTPs浓度为10 mM，体积为1 μL；限制性内切酶为0.5μL浓度为10 U/μL的Nt.BbvCI。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中加入HEPES缓冲液的体积为108μL，浓度为10 mM；加入氯化血红素溶液的体积为2μL浓度为50 μM。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中加入双氧水的体积为10 μL，浓度为20 mM；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积为10 μL，浓度为10 mM。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中紫外可见分光光度计的测试波长范围为350-750 nm。