[发明专利]一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用

说明书

本发明公开了一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明通过将角蛋白酶的前导肽进行突变大大提高了角蛋白酶的产量；将本发明的以由编码信号肽的基因、编码前导肽突变体的基因以及编码角蛋白酶的基因依次串联而得的DNA片段为目的基因，以pP43NMK质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主构建得到的可高产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵，发酵24h，即可使得发酵上清液中的酶活高达109290～157080U/mL。

技术领域

本发明涉及一种前导肽突变体及其在角蛋白酶生产中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一种能够降解不可溶的硬质蛋白--角蛋白类底物（例如羽毛、羊毛、头发、皮屑等）的特异性蛋白酶，其主要由细菌、真菌、放线菌等微生物在以角蛋白为单一碳氮源时生长分泌获得。

作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，角蛋白酶可以替代传统蛋白酶，广泛应用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等领域，具有巨大的市场。

但是，野生角蛋白酶的性能拙劣、产量低下，远远不能满足市场需求，因此，它很难被真正应用于工业化生产中。

现在，常常采用构建基因工程菌的手段，强化角蛋白酶基因的转录和翻译，以达到提高角蛋白酶产量的目的，例如，Porres J M等人以来源于B. licheniformis MKU3的编码角蛋白酶基因为目的基因、以pPICZαA为载体、以Pichia pastoris X33为宿主构建得到了一株可产角蛋白酶的基因工程菌，将此基因工程菌发酵24 h，仅可使发酵上清液中的酶活达到285 U/L（具体可见参考文献：Porres J M, Benito M J, Lei X G. Functionalexpression of keratinase (kerA) gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris. Biotechnology Letters[J], 2002, 24(8): 631-636.）；Fang等人以来源于Stenotrophomonas maltophilia的编码角蛋白酶基因为目的基因、以pET22b为载体、以大肠杆菌DE3为宿主构建得到了一株可产角蛋白酶的基因工程菌，将此基因工程菌发酵72 h，仅可使发酵上清液中的酶活达到712 U/L（具体可见参考文献：Zhen Fang, Juan Zhang,Baihong Liu, Linghuo Jiang, Guocheng Du, Jian Chen. Cloning, heterologousexpression and characterization of two keratinases from Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1. Process Biochemistry. 2014, 49.4: 647-654.）。但是，上述产量仍旧未能达到工业化生产的水平。

因此，急需找到一种提高角蛋白酶产量的方法以满足工业化生产的要求。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的生产角蛋白酶的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种前导肽突变体，所述前导肽突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的前导肽的第76位亮氨酸、第39位天冬氨酸、第17位丝氨酸、第18位甘氨酸、第37位天冬氨酸、第48位丙氨酸或第57位谷氨酸进行突变得到的。