[发明专利]一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法

说明书

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，提取待检样品中H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因DNA制备DNA模板溶液，和提前设计的HA基因与NA基因的引物与探针一起制备微滴，然后进行PCR扩增，最后用微滴分析仪检测得到H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数。该方法检测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数的灵敏度高，可通过数字PCR技术检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数，建立实验的优势，增加可信度。

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法。

背景技术

目前，家禽年出栏量和产值在逐年上升，但禽流感的持续爆发严重危害了养禽业，不仅造成了巨大的经济损失，还引起了多起公共卫生事件，接种禽流感疫苗是最有效的防控手段，因此必须提高禽流感疫苗技术水平。

传统禽流感疫苗通过鸡胚培养生产，效率低、成本高、品质不稳定。国内多家单位也开展了禽流感细胞苗的研究，但由于微载体工艺扩大困难、细胞密度和病毒滴度较低等的因素制约了其产业化进程。而细胞悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是生物制药行业发展的必然趋势，该技术完全克服了以往技术的弊端。

全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚或贴壁细胞生产禽流感病毒缺点基础之上建立的一种先进的培养方式，即能节约成本、省时省力、又能扩大培养，生产高质量、高滴度的禽流感病毒。然而目前全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒工艺尚未成熟，未能把握H9N2亚型禽流感病毒增值的关键因素,无法来满足市场对大量生产H9N2亚型禽流感病毒疫苗的需求。目前虽然可以从HA滴度值、鸡胚半数感染量、单位细胞均产毒量、活细胞密度等方面探讨无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的规律及优化，但是未曾有文献报道从基因水平来分析不同参数下禽流感病毒增值的规律，例如利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用数字PCR检测H9N2亚型禽流感病毒含量的方法，提取待检样品中H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因DNA制备DNA模板溶液，和提前设计的HA基因与NA基因的引物与探针一起制备微滴，然后进行PCR扩增，最后用微滴分析仪检测得到H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数。该方法检测H9N2亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因的拷贝数的灵敏度高，可通过数字PCR技术检测H9N2亚型禽流感病毒含量来优化无血清全悬浮MDCK细胞增值H9N2亚型禽流感病毒的技术参数，建立实验的优势，增加可信度。

本发明的技术方案为：

一种用于检测H9N2亚型禽流感病毒含量的特异性引物与探针组合，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其中一对特异性引物为HA-F和HA-R，对应的探针为HA-P；另外一对特异性引物为NA-F和NA-R，对应的探针为NA-P；

其中，引物HA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；

引物HA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；

探针HA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；

引物NA-F的的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

引物NA-R的的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；

探针NA-P的的核苷酸序列如SEQ NO.6所示

其核苷酸序列分别为：

HA-F：attgtaggtcccgttccga(SEQ NO.1)