[发明专利]检测百香果木质化病毒病的RT-PCR引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测百香果木质化病毒病的RT‑PCR引物组，包括特异引物PWV‑F和特异引物PWV‑R，所述特异引物PWV‑F具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述特异引物PWV‑R具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明方法样品需求量少、技术难度小、准确性高、适用于大规模样品分析；不仅能诊断疑似百香果木质化病毒侵染症状的样品，还能鉴定病毒处于潜伏阶段而未表现出明显症状的样品，能实现感病植株的早期诊断。

技术领域

本发明属于果类检疫性病害检测技术领域，特别涉及一种检测早期百香果木质化病毒病的RT-PCR引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

随着广西百香果的良好市场形势和种植年份的丰收，百香果已在许多地方普及，成为“短、平、快”的精准扶贫项目。近年来广西百香果种植面积不断扩大，2016年为17.8万亩，2017年为30万亩，2018年为41万亩。由于种植管理普遍粗放、不注重源头选苗，果农对病虫害没有进行及时的防治等原因，大多数果园疫病、茎基腐病、病毒病等发生普遍，导致了广西百香果种植的产量和品质偏低。其中百香果木质化病是百香果最为重要的病毒病害，该病表现为叶片皱缩、畸形、花叶，植株长势弱小，果皮变厚变硬、瘤状突起，果实木质化和严重畸形。严重影响了百香果的产量和品质，已成为制约产业发展的重要因素。国内百香果木质化病毒病最早发现于台湾地区，目前在国内其它百香果种植地区也相继发现了木质化病毒侵染的植株，产业发展面临潜在威胁。广西南宁市武鸣区、贵港市、崇左市等百香果种植产业区，特别是连年种植3年以上的基地，木质化病毒病发病较为严重。

无病毒苗木繁育及推广是保障百香果产业持续、健康发展的基础，而病毒检测是无毒苗繁育、推广的关键技术之一。

病毒检测方法包括生物学检测、电子显微镜检测和血清学检测。生物学检测耗时长，且受环境条件限制。电子显微镜检测结果直观、准确，由于仪器设备昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人技术水平要求高，因此并没有得到广泛应用。血清学方法具有快速、直观等特点，但其结果的准确性往往依赖于抗血清的品质，且无法检测不稳定的病毒。

反转录聚合酶链反应(RT-PCR)是20世纪90年代发展起来的一种检测植物RNA病毒的方法，该方法灵敏度高、取样量少、特异性强，适用于病毒样品的批量检测。基于以上优势，RT-PCR已广泛应用于多种植物病毒的检测。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，通过设计百香果木质化病毒(Passionfruitwoodiness virus,PWV)外壳蛋白基因片段的特异性引物，应用RT-PCR技术扩增目的基因片段，从而实现对病毒的准确检测。RT-PCR技术的样品需求量少、技术难度小、准确性高、适用于大规模样品分析。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种检测百香果木质化病毒病的RT-PCR引物组，包括特异引物PWV-F和特异引物PWV-R，所述特异引物PWV-F具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述特异引物PWV-R具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

一种检测百香果木质化病毒病的RT-PCR引物组的试剂盒，反应体系包含以下成分：2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL，2mM dNTPs 5.0μL，PWV-F(10μmol·L^-1)0.75μL，PWV-R(10μmol·L^-1)0.75μL，KOD FX(1.0U·μL^-1)0.5μL，cDNA第一链3.0μL，ddH₂O 2.5μL。