[发明专利]一种基因甲基化的检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种基因甲基化检测方法，通过用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，然后对酶切产物进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。本发明方法通过对PCR引物的独特设计，大大提升了基因甲基化检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因甲基化的检测方法和应用。

背景技术

DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此，研究基因的甲基化对癌症的早期筛查具有非常重要的意义。

以结直肠癌为例，研究表明，结直肠癌的发生过程中伴随着众多抑癌基因启动子CpG岛区域的甲基化，这为我们开发新的结直肠癌筛查技术提供了理论基础。FDA已经于2014年批准产品Cologuard用于结直肠癌筛查，其检测标志物包含BMP3和NDRG4基因甲基化，该产品主要面向北美地区的人群。在我国，血浆游离DNA中Septin9基因甲基化检测以及粪便DNA中SDC2基因甲基化检测用于结直肠癌辅助诊断的两个产品已经获批上市，这有助于进行大范围的开展结直肠癌的早诊早筛工作。

虽然基因甲基化检测的产品已经获批用于临床，但是目前的产品普遍存在检测标志物单一、方法为传统的亚硫酸盐转化及荧光定量PCR检测，因此其灵敏度和特异性还有待提升。

传统的亚硫酸盐转化是利用亚硫酸盐将核酸中未甲基化的胞嘧啶(C)转化为脲嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，转化后甲基化的CpG岛和未甲基化CpG岛就存在明显的序列差异性，通过设计甲基化特异性引物进行荧光定量PCR就可以检测样本核酸中是否存在目标基因甲基化，该方法具有极高的特异性。但是，亚硫酸盐转化会造成DNA严重碎片化，且纯化后会造成大量的DNA损失，因此会极大的影响检测灵敏度，造成假阴性检测结果。

此外，血浆游离DNA来自于人体周身且浓度极低,来源于肠道肿瘤细胞的DNA更微量且具有极大的个体差异性；粪便核酸主要为肠道菌群DNA，其包含的人源性DNA来自于整个消化道脱落细胞及其降解释放的DNA，所占比例仅为全部DNA的1％不到，来源于肿瘤细胞的DNA所占比例就更低了。因此，如何高效利用本就微量的样本DNA进行检测达到提升灵敏度的目的就尤为重要了。

发明内容

针对现有技术中所存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种区别于传统的亚硫酸盐转化的方法，结合独特的引物设计进行荧光定量PCR进行检测，大大提升了基因甲基化的检测灵敏度。

本发明所采取的技术方案是：

一种基因甲基化检测方法，包括以下步骤：

(1)用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，得到酶切产物；

(2)步骤(1)得到的酶切产物进行PCR扩增，PCR扩增引物组包括目标基因引物组，目标基因引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基，优选为“CGC”；此外，引物序列所包含的“CGCG”位点个数可根据具体模板序列进行选择，优选的包含“CGCG”位点数越多，其特异性越高，但需考虑引物的GC比例；

(3)根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。

优选地，目标基因引物组的扩增子包含至少一个“CGCG”位点。上下游引物之间“CGCG”位点的数目可根据目标序列进行选择，优选的扩增区域覆盖的“CGCG”位点数越多扩增特异性越高。