[发明专利]猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒

说明书

本发明公开了猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物，包括上游引物qEV‑G‑F和下游引物qEV‑G‑R，它们分别具有序列表的SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。据此，发明人建立了相应EV‑G实时荧光定量PCR检测方法。研究表明，本发明具有较好的特异性、敏感性和重复性，检测只需在3小时内即可完成，快捷省时，成本低，用于临床样品中可实现EV‑G的快速检测，对该病的监控和检测具有重要意义。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测技术领域，尤其涉及猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。

背景技术

近年来，伴随着我国生猪养殖业的快速发展，规模化程度不断提高，新的腹泻类病毒在我国猪群中不断被发现，其造成的危害也日趋严重。猪肠病毒G型(PorcineEnterovirus G，EV-G)，是猪群中普遍存在的一种肠道病毒，猪是EV-G唯一的自然宿主，不同日龄的猪均对该病毒有易感性且感染后有多种不同的临床表现，如腹泻、脑脊髓灰质炎、生殖障碍等。Yang等人，2008年3月至2009年5月从我国14个养猪场采集的447份粪便样本进行RT-PCR检测，结果显示，被检猪群中普遍存在EV-G的感染，且10-15周龄猪的阳性率达10.1％，该病毒给我国猪群健康造成很大的潜在威胁。

EV-G属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为单股正链RNA病毒，无囊膜，病毒粒子直径22-30nm，呈球形，EV-G的基因组全长约7.3kb，整个基因组只有一个开放阅读框，3’端有polyA尾，5’端有一个由共价相连接的小蛋白VPg。在临床表现中，EV-G与猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)的症状相似，临床上对其难以进行区分，并且猪群中常同时存在几个肠病毒血清型，任何年龄猪在感染某一血清型毒株后，常可见再感染其他血清型毒株。目前实验室对该病的检测一般采取普通RT-PCR方法，但是普通PCR的灵敏性较低，操作繁琐，耗时较长。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供特异性强、灵敏度高、重复性好且操作便捷的猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物，包括上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R，它们分别具有以下碱基序列：

上游引物qEV-G-F：5’-CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3’；

下游引物qEV-G-R：5’-GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3’。

上述PCR检测引物在扩增猪肠病毒G型的ORF基因中的应用。

扩增反应条件为95℃预变性120s；再以40个循环进行扩增，每循环以95℃15s变性，64℃延伸60s。

猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测试剂盒，含有上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R，它们分别具有以下碱基序列：

上游引物qEV-G-F：5’-CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3’；

下游引物qEV-G-R：5’-GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3’。

上述试剂盒，包括以下试剂：阳性对照标准品、PCR反应液、阴性对照；阳性对照标准品为含有猪肠病毒G型基因序列的重组质粒，PCR反应液包括上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R、(2x)TB Green^TM Premix Ex Taq^TM II，阴性对照为双蒸水。

重组质粒以pMD18-T为载体。

上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R的摩尔比为1：1。